论文总字数：8032字

摘 要

近年来，猪链球菌病的一些非典型症状逐渐增多，猪链球菌的耐药性逐渐增强，给养猪行业带来了较大的损失，并严重威胁到社会公共卫生安全。本实验采用药敏纸片扩散法对分离于淮安猪场的12株猪链球菌进行20种常用抗生素的耐药性实验。实验结果表明：分离的猪链球菌对新霉素、丁胺卡那、哌拉西林、羧苄西林以及头孢菌素类高度敏感，对红霉素、多西环素、四环素、卡那霉素和庆大霉素耐药严重。

关键词：猪链球菌，耐药性，药敏试验

Abstract: Streptococcosis suis(SS) was the serious cause of economic loss of pig industry and spread widely in the world. It also caused threaten to the public health. In this paper, we used agar diffusion method(K-B method) to analyze the drug resistance of the 12 SS strains insolated form Huaian on 20 common antibiotics. The results showed that the separation of streptococcus suis to Neomycin,Amikacin, Piperacillin, Carbenicillin and Cephalosporins were highly sensitive, and the strains were drug resistant to Erythromycin, Doxycyline, Tetracyline, Kanamycin and Gentamicin.

Keywords: streptococcus suis, drug resistance, drug sensitivity test

1 前言

猪链球菌是一种重要的人畜共患病病原，该菌可导致猪关节炎、脑膜炎及支气管炎等，还可引起人类感染胸膜炎、败血症等，甚至死亡^[1]。近年来随着养猪业规模化发展，种猪的调运和交易日趋频繁，从而使猪链球菌病发病率明显上升^[2]，对养猪业及公共卫生安全产生严重威胁。目前，对于猪链球菌病的防治主要是应用青霉素类、头孢类、氨基糖苷类、大环内酯类、林可胺类以及喹诺酮类抗菌药物^[3]。但近年来，由于抗生素的滥用，使得猪链球菌的耐药性日趋严重^[4]。为此，对12株猪链球菌进行药敏试验，以期为猪链球菌病的防治提供参考。

1.1 耐药性现状

近年来，各种抗生素的发现与使用，使得大多数细菌性疾病得到有效控制，但是随着抗生素的普遍使用，耐药性的问题也越来越严重。倪宏波等在2001~2002年在长春地区分离出20株猪链球菌，并且进行耐药性实验，结果显示，其中的5株菌株对红霉素、链霉素、四环素的耐药性都比较高^[5]。2004年杨建江等测定了长春地区不同猪场的22株猪链球菌对于6种常用抗生素的耐药性，结果表明，所有菌株对青霉素的敏感性较高，对克林霉素的耐药性较高，80%以上的菌株都对环丙沙星、红霉素和阿奇霉素耐药^[6]。2005年~2007年，张纯萍等对从10个省市的13个猪场分离鉴定出来的421株猪链球菌进行耐药性测定，结果显示这421株猪链球菌对四环素、大环内酯类、林克酰胺类和磺胺类抗菌药物耐药情况严重^[7]。2010年，邢娟等对从甘肃省部分地区分离的67株猪链球菌所作的耐药性测定表明，全部猪链球菌分离株具有多重耐药性，最严重者对22 种常用抗生素中的16种抗生素产生耐药性^[8]。2012年，刘静等对从黑龙江省某猪场分离到的10株猪链球菌并进行了耐药性测定，结果表明大部分菌株具有多重耐药性，所有分离株对红霉素、氧氟沙星、磺胺甲噁唑的耐药性尤为严重^[9]。

2 材料和方法

2.1 材料与试剂

2.1.1 菌株

菌株：2014-2015年间自淮安某猪场分离鉴定的12株猪链球菌

2.1.2 试剂及培养基

无菌脱纤维绵羊血购自南京便诊生物科技有限公司；

M-H琼脂培养基是OXOID品牌的。

2.1.3 药敏试纸及抗生素

药敏试纸购自杭州微生物试剂有限公司，共20种，药物如下：红霉素，米诺环素，多西环素，四环素，新霉素，卡那霉素，庆大霉素，丁胺卡那，头孢哌酮，头孢曲松，头孢呋辛，头孢他啶，头孢唑林，头孢拉定，头孢氨苄，哌拉西林，羧苄西林，氨苄西林，苯唑西林和青霉素。

2.2 实验方法

2.2.1 培养基配置

称取7.6g M-H 琼脂培养基于200mL蒸馏水中，搅拌均匀。放在高压灭菌锅中灭菌15分钟，待灭菌锅温度降到50度左右拿出培养瓶。在培养瓶中加入10mL的无菌脱纤维绵羊血，充分混匀，在培养基凝固之前尽快倒完，倒平板的厚度约为4mm。

2.2.2 药敏实验

采用纸片扩散法，将分离得到的12个菌株分别放在LB培养基中培养18~24小时，用无菌生理盐水将菌液浊度调至0.5麦氏单位，直接将这个盐水悬浊液作为接种物。接种物的悬浊度调节好后，最好在15分钟内接种，用无菌棉签蘸取调好的菌液，在悬浊液面上方管壁处旋转反复挤压几次，挤出过多的菌液。用无菌棉签在无菌的干燥的加5%无纤维绵羊血的M-H琼脂培养基表面涂布接种，接种的时候应该保证菌液均匀分布，最后还应该用无菌棉签涂抹培养基的边缘。

在贴药敏纸片之前，可以将培养皿半开3~5分钟，但不超过15分钟，以便表面过多的水分被吸收。最后将药敏纸片贴于接种好菌的平板表面，每个药敏纸片都要轻压一下，确保与琼脂表面完全接触。药敏试纸应均匀分布，中间间距不小于24毫米，因为有些药物会立刻扩散，所以试纸只要一接触培养基表面就不应再移动位置，应该在其他地方贴新的试纸。同时贴不同的药敏试纸时使用的镊子应在酒精灯上烧一下，防止不同的抗生素之间污染。贴完药敏试纸后，应在15分钟内将平板倒扣，放在恒温培养箱中37℃培养18~20小时后，测量抑菌圈的大小，实验结果为3次测量的平均值。判断猪链球菌敏感性大小指标请见表1。

表1 药敏实验判断标准

药物	纸片含药量	抑菌圈直径/mm
中文名 英文名	ug/片	R	I	S
红霉素 Erythromycin	15	≤15	16~20	≥21
米诺环素 Minocycline	30	≤14	15~18	≥19
多西环素 Doxycycline	30	≤12	13~15	≥16
四环素 Tetracycline	30	≤18	19~22	≥23
新霉素 Neomycin	30	≤12	13~16	≥17
卡那霉素 Kanamycin	30	≤12	13~14	≥15
庆大霉素 Gentamicin	10	≤12	13~14	≥15
丁胺卡那 Amikacin	30	≤12	13~14	≥15
头孢哌酮 Cefoperazone	75	≤15	16~20	≥21
头孢曲松 Ceftriaxone	30	≤24	25~26	≥27
头孢呋辛 Cefuroxim	30	≤14	15~22	≥23
头孢他啶 Ceftazidime	30	≤14	15~17	≥18
头孢唑啉 Cefamezin	30	≤14	15~17	≥18
头孢拉定 Cefradine	30	≤14	15~17	≥18
头孢氨苄 Cephalexin	30	≤14	15~17	≥18
哌拉西林 Piperacillin	100	≤17	18~20	≥21
羧苄西林 Carbenicillin	100	≤19	20~22	≥23
氨苄西林 Ampicillin	10	≤18	19~25	≥26
苯唑西林 Oxacillin	1	≤18	19	≥20
青霉素 Penicillin	10	≤19	20~27	≥28

注：“R”为耐药；“I”为中度敏感；“S”为高度敏感

3 结果与分析

3.1 药敏试验结果

对12株猪链球菌分离株药敏试验结果如下表2，表3

表2 12株分离株的药敏试验结果

抗菌药物名称	抑菌圈直径/mm
	SY1B4	SY1B5	SY1B8	SY1G2	SY1G3	SY1G4	SY1G5	SY1G6	SY1G7	SY2G5	SY2G6	SY2G7
红霉素	0	0	0	0	0	0	0	0	0	7	8	0
米诺环素	19	18	20	19	20	18	15	15	23	16	14	13
多西环素	11	12	12	12	15	13	11	11	23	11	11	12
四环素	14	12	10	11	12	11	12	10	22	9	10	10
新霉素	20	20	19	20	19	20	19	17	19	14	14	14
卡那霉素	0	0	0	0	0	0	0	0	22	17	15	11
庆大霉素	0	0	0	0	0	0	0	0	22	20	15	14
丁胺卡那	15	15	19	18	21	18	18	19	25	22	21	14
头孢哌酮	27	24	22	20	22	26	21	20	21	22	22	21
头孢曲松	31	25	24	26	29	30	30	26	22	29	26	23
头孢呋辛	31	20	19	22	28	26	30	21	30	22	25	27
头孢他啶	17	20	0	20	22	23	22	24	26	24	30	15
头孢唑啉	29	25	25	24	29	30	24	27	25	24	30	22
头孢拉定	26	25	26	30	32	32	28	27	26	27	26	22
头孢氨苄	28	23	22	25	30	27	22	25	27	25	26	23
哌拉西林	28	26	24	28	27	26	24	22	26	26	20	23
羧苄西林	28	26	24	24	26	25	28	24	28	27	22	24
氨苄西林	26	26	23	27	26	25	26	24	26	26	15	22
苯唑西林	16	0	0	0	0	0	0	0	0	0	0	13
青霉素	26	23	21	27	22	25	24	17	22	13	12	24

表3 12株分离株药敏实验统计

药物	敏感株	中度敏感株	耐药株	高敏率%	耐药率%
红霉素	0	0	12	0	100
米诺环素	5	5	2	41.7	16.7
多西环素	1	2	9	8.3	75
四环素	0	1	11	0	91.7
新霉素	9	3	0	75	0
卡那霉素	3	0	9	25	75
庆大霉素	3	1	8	25	66.7
丁胺卡那	11	1	0	91.7	0
头孢哌酮	10	2	0	83.3	0
头孢曲松	5	4	3	41.7	25
头孢呋辛	7	5	0	58.3	0
头孢他啶	9	2	1	75	8.3
头孢唑啉	12	0	0	100	0
头孢拉定	12	0	0	100	0
头孢氨苄	12	0	0	100	0
哌拉西林	11	1	0	91.7	0
羧苄西林	11	1	0	91.7	0
氨苄西林	7	4	1	58.3	8.3
苯唑西林	0	0	12	0	100
青霉素	0	9	3	0	25

药敏试验结果表明，分离的12株猪链球菌对这20种抗生素有不同的耐药性，对新霉素、丁胺卡那、头孢哌酮、头孢他啶、头孢唑啉、头孢拉定、头孢氨苄、哌拉西林和羧苄西林等高度敏感，高敏率分别为75%、91.7%、83.3%、75%、100%、100%、100%、91.7%和91.7%；对红霉素、多西环素、四环素、卡那霉素和庆大霉素等均表现耐药，其中红霉素为100%耐药。

表4 12株菌株多重耐药性统计

多重耐药性
耐药药物/种	菌株数/株	百分比/%
3	1	8.3
5	3	25
6	4	33.3
7	3	25
8	1	8.3

由表2及表4可知，12株猪链球菌均有多重耐药性，其中菌株SY1B8对8种药物都具有抗性，另外菌株SY1G6、SY2G6、SY2G7对7种药物有抗性，占总数的25%；菌株SY1B4、SY1B5、SY1G2和SY1G5对6种药物有抗性，占总数的33.3%；菌株SY1G3、SY1G4和SY2G5对5种药物有抗性，占总数的25%；菌株SY1G7对3种药物产生抗性，占总数的8.3%。

在以往的较多实验中，我们发现猪链球菌对青霉素类是比较敏感的，而在本次实验中菌株SY1G6、SY2G5、SY2G6这三株菌株是对青霉素产生耐药的。菌株SY1G6除了对青霉素耐药外，还对红霉素、多西环素、四环素、卡那霉素、庆大霉素和苯唑西林耐药；菌株SY2G5还对红霉素、多西环素、四环素、和苯唑西林产生抗性；菌株SY2G6还对红霉素、米诺环素、多西环素、四环素、氨苄西林和苯唑西林。由此看出这三株菌株的耐药性是比较严重的。

结论

猪链球菌病是一种常见的遍布全世界的猪传染病，给养猪行业带来了较大的经济损失。猪链球菌病的发病率不高，多以散发或地方流行性为主，近几年来，猪链球菌病又成了猪圆环病病毒、猪繁殖与呼吸综合征、猪伪狂犬病等病毒病的主要继发或并发病^[10]。多年来，养殖场使用抗生素对猪链球菌病的防治取得了较好疗效，但由于用量大、用药时间长或未经兽医诊断就盲目使用抗生素等原因，使其产生了耐药性，导致防治效果越来越差。一旦发生猪链球菌感染的情况，往往会因为不知道它的药敏性而导致未能选择最佳抗生素，从而失去了最佳治疗的时机，导致一系列的损失。

此次药敏试验的结果为较好地合理地使用抗生素来防治猪链球菌病提供了参考。药敏试验的结果表明，所分离的菌株已经对红霉素、多西环素、四环素、卡那霉素和庆大霉素等抗生素产生了较强的耐药性，而这几种抗生素通常被认为是对治疗猪链球菌病很有效的。根据药敏试验的结果来看，所分离的菌株对头孢菌素类、新霉素、丁胺卡那、哌拉西林、羧苄西林和氨苄西林等抗生素都非常敏感，所以这些抗生素都可以作为预防和治疗猪链球菌病的一个很好的选择。本实验以及其他研究者的实验结果提醒人们切勿滥用抗生素，要对滥用抗生素所带来的隐患予以足够的重视。

猪链球菌容易产生耐药性，所以在预防和治疗过程中不能长期使用同一种抗生素，应该经常更换，或几种抗生素联合交替使用，并且应严格按照药物的使用说明正确使用，不能随意加大剂量，尽量避免耐药株的出现。不同地区的菌株耐药性并不一致，即使是同一地区的菌株耐药性也会有较大差异，所以在用药前最好进行药敏试验来确定药物，以期经济、高效。因为猪链球菌病极易与其他病症混淆，所以应在确诊的基础上有针对性地使用抗生素。定期的对各个地区的猪链球菌进行耐药性监测也是防治猪链球菌病的一个有效措施。预防猪链球菌病需要加强各个环节的管理，养殖场应该加强日常的饲养管理和清洁消毒工作，一旦发现病猪应及时地隔离治疗。为了防止病原扩散对病死的猪应做无害化处理，并且对于被病猪污染的地方及用具应进行全面严格的消毒。

参考文献

[1] 唐艳林, 宋桂才, 宋桂玲, 等. 猪繁殖与呼吸综合征疫苗的研究进展[J]. 黑龙江畜牧兽医杂志, 2010(5):39-40.

[2] 王君玮, 刘国庆, 丁德鹅, 等. 猪生殖与呼吸综合征油乳剂灭活疫苗的制备及安全性试验[J]. 中国动物检疫,2005(2):28-29.

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