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摘 要

目的：N-糖基化是毕赤酵母中蛋白质翻译后修饰时对蛋白质正确折叠和表达的一种常见形式，而铜绿假单胞菌弹性蛋白酶的前导肽在其中起着不可或缺的作用。通过定点突变，在重组弹性蛋白酶前导肽中引入四个N-糖基化位点，分析在前导肽中引入N-糖基化位点对该弹性蛋白酶在毕赤酵母中表达的影响。方法：以构建好的克隆质粒pGH-T/lasB为模板，通过定点突变（D11N、K53S、A95S和K129S），在重组弹性蛋白酶前导肽中引入四个N-糖基化位点。利用突变引物进行PCR扩增以得到突变质粒；将突变的lasB基因亚克隆到表达质粒pPIC9K上；电转化到毕赤酵母中并诱导表达。经纯化获得重组弹性蛋白酶，并对在前导肽引入N-糖基化位点是否促进弹性蛋白酶的表达进行了研究。结果：K53S和A95S突变促进了弹性蛋白酶在毕赤酵母中的表达,D11N和K129S突变抑制了其在毕赤酵母中的表达。

关键词：N-糖基化，定点突变，弹性蛋白酶，毕赤酵母，前导肽，蛋白质表达

Abstract: Objective: N-Glycosylation is a common form of protein post-translational modification in Pichia pastoris and greatly affects folding and secretion. The propeptide of the Pseudomonas aeruginosa elastase (PAE) is indispensable for its proper folding and secretion. Four N-glycosylation sites were introduced into the propeptide of the rPAE by site-directed mutagenesis. The effect on the enhanced expression of recombinant elastase in Pichia pastoris through addition of N-glycosylation sites to the propeptide was analyzed. Methods: Using plasmid pGH-T/lasB as template, four N-glycosylation sites (D11N, K53S, A95S and K129S) were introduced into the propeptide of the recombinant PAE (rPAE) by site-directed mutagenesis; Mutation primers were used to obtain the plasmid mutation; the mutated lasB was subcloned into the expression plasmid pPIC9K; the plasmid was then transformed into Pichia pastoris by electroporation. Purified recombinant elastase was collected, and the relationship between N-glycosylation and the expression of rPAE was analyzed. Results: Compared with the wild-type rPAE, the expression levels of K53S and A95S mutant were considerably enhanced, while D11N or K129S mutation inhibiting rPAE production levels in Pichia pastoris.

Key words: N-glycosylation, Site-directed mutagenesis, Pseudomonas aeruginosa elastase, Pichia pastoris，Propeptide，Protein expression

目 录

引言： 4

1 实验材料及仪器 7

1.1 酶、菌株与质粒 7

1.2 试剂与溶液 7

1.3 实验仪器 8

2 实验方法 8

2.1 定点突变 8

2.2 目的基因的亚克隆 10

3 实验流程 11

3.1 基因定点突变 11

3.1.1 引物设计 11

3.1.2 原突变位点附近基因序列 11

3.1.3 引物序列 12

3.1.4 聚合酶链式反应 12

3.2 感受态制备和目的基因的转化 12

3.2.1 大肠杆菌感受态制备 12

3.2.2 目的基因的转化 13

3.2.3 提取质粒并测序 13

3.3 目的基因的亚克隆 13

3.3.1 乙醇沉淀DNA 13

3.3.2 酶切 13

3.3.3 目的基因的连接 14

3.3.4 再次转化筛选 14

3.4 诱导产酶 14

3.4.1 毕赤酵母电转化方法 14

3.4.2 菌体的准备 14

3.4.3 电击转化 14

3.4.4 诱导产酶培养 15

3.5 聚丙烯酰胺凝胶电泳 15

3.5.1 染色和脱色 15

3.6 弹性蛋白酶酶活力的测定 15

4 结果与讨论 16

结论 19

参考文献 20

致 谢 22

引言：

铜绿假单胞菌(Pseudomonas aeruginosa)，是一种典型的机会致病菌，在人体烧伤、器官移植等情况下引起严重感染，危害人体健康甚至生命。该菌产生多种蛋白酶之一的弹性蛋白酶，其英文术语为pseudolysin，也称Pseudomonas aeruginosa neutral metalloproteinase、Pseudomonas aeruginosa elastase、Pseudomonas elastase。这种蛋白酶是属于蛋白酶M4 家族的，即嗜热菌蛋白酶家族（thermolysin family）。弹性蛋白酶是由铜绿假单胞菌（Pseudomonas aeruginosa）产生的一种胞外分泌型的锌金属蛋白酶^[1-4]。它由lasB基因编码，该基因的开放阅读框含有 1497 个碱基对，编码分子量为 53.7kDa的多肽（498 个氨基酸残基，prepropseudolysin）。在这个多肽的氨基酸序列中，前 23 个氨基酸残基为信号肽（signal peptide），其分子量为 2.4kDa；然后是有 174 个氨基酸残基组成的前导肽（propeptide），它的分子量是 18.2kDa；最后是由 301 个氨基酸残基组成，分子量为 33.1 kDa的成熟蛋白酶（mature protease）^[1,2,5]。当弹性蛋白酶的成熟蛋白分泌到细胞外，可以降解病灶细胞外基质，在铜绿假单胞菌感染的过程中起重要作用。因此，获得纯化的弹性蛋白酶，对于研究其致病机理，具有重要意义。

弹性蛋白酶在实际生活生产中有很高的应用价值，广泛存在于自然环境中的角蛋白，就可以被弹性蛋白很好的降解，在羽毛蛋白方面弹性蛋白发挥着重要的作用，同时它在食品行业、日常化学化工领域具有很好的前景，拥有比较高的商业和应用价值^[6-8]。在食品行业，因为弹性蛋白酶广泛的水解底物，非常多的动植物蛋白都能被它所水解，尤其是动物韧带、筋腱等动物组织中的一些难以被处理的蛋白，因此弹性蛋白酶在农副产品的深加工以及高蛋白的食品的制作等方面具有一定的应用价值^[9，10]。在化学工业上，由于弹性蛋白酶在有机溶剂的较好的稳定性和较高的活性广泛用作多肽和成的催化剂。除此之外，弹性蛋白酶还具有能够维持纤维血管正弹性的特别功能，而且还能发挥出增进、改善皮肤的血液循环，改善皮肤代谢，延缓皮肤老化，促进毛发的生长，有效的预防头发脱落的作用^[11]。

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