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摘 要

N-糖基化修饰是毕赤酵母表达系统中最常见的对蛋白的一种表达后修饰方式，其糖基化修饰的差异可能会影响到酶在稳定性、活性和表达水平。毕赤酵母中的弹性蛋白酶的N-糖基化修饰位点序列为Asn-Xaa-Ser/Thr，而且，Asn-Xaa-Thr的糖基化效率比Asn-Xaa-Ser更高。本文对这两个序列在重组弹性蛋白酶（rPAE）中表达的作用进行了研究。在rPAE的N43，N212和N280这三个位点上，通过定点突变用Asn-Xaa-Thr是取代天然的Asn-Xaa-Ser序列，并且在rPAE的N36和N264位点的将这两个序列子形式引入。正如预期的那样，在N36，N43，N212和N280上，其糖基化水平显著地提高。结果验证了Asn-Xaa-Thr的糖基化水平比Asn-Xaa-Ser更高。

关键词：N-糖基化，定点突变，弹性蛋白酶，毕赤酵母

Abstract: N-glycosylation is one of the most common forms of protein post-translational modification in Pichia pastoris. Differences in glycosylation may affect stability, activity and expression level of the enzyme. N-glycosylation usually occurs at the Asn-Xaa-Ser/Thr sequon of glycoproteins in P. pastoris, however, Asn-Xaa-Thr is more efficiently glycosylated than Asn-Xaa-Ser. In this study, the role of the two sequons in the expression of recombinant elastase (rPAE) was investigated. At N43, N212, and N280 of rPAE, Asn-Xaa-Thr was substituted for the native Asn-Xaa-Ser sequon through site-directed mutagenesis, and the two sequon forms were introduced into rPAE at N36 and N264. As expected, substitution at N36, N43, N212, and N280 enhanced the degree of N-glycosylation. These results show that the tripeptide sequon Asn-Xaa-Thr is glycosylated more efficiently than Asn-Xaa-Ser.

Key words: N-glycosylation, Site-directed mutagenesis, Protein expression, Pichia pastoris

目 录

引言： 4

1 实验材料及仪器 5

1.1 酶、菌株与质粒 5

1.2 试剂与溶液 6

1.3 实验仪器 6

2 实验方法 7

2.1 定点突变 8

2.2 目的基因的亚克隆 9

3 实验流程 10

3.1 基因定点突变 10

3.1.1 引物设计 10

3.1.2 原突变位点附近基因序列 10

3.1.3 引物序列 11

3.1.4 聚合酶链式反应 11

3.1.5 琼脂糖凝胶电泳 11

3.2 感受态制备和目的基因的转化 12

3.2.1 大肠杆菌感受态制备 12

3.2.2 目的基因的转化 12

3.2.3 提取质粒并测序 12

3.3 目的基因的亚克隆 12

3.3.1 乙醇沉淀DNA 12

3.3.2 酶切 13

3.3.3 目的基因的连接 13

3.3.4 再次转化筛选 13

3.4 诱导产酶 13

3.4.1 毕赤酵母电转化方法 13

3.4.2 菌体的准备 13

3.4.3 电击转化 14

3.4.4 诱导产酶培养 14

3.5 聚丙烯酰胺凝胶电泳 14

3.5.1 染色和脱色 14

3.6 弹性蛋白酶酶活力的测定 14

4 结果与讨论 15

结论 17

参考文献 16

致 谢 20

引言：

铜绿假单胞菌(Pseudomonas aeruginosa)，是人体内一种典型的条件致病菌，会在烧伤、免疫缺陷、器官移植及一些医院感染病人中引起严重感染，严重危害大家的健康和生命，威胁到整个社会的稳定。铜绿假单胞菌菌可以产生多种有害的物质，它产生的弹性蛋白酶，英文术语为Pseudomonas aeruginosa elastase（PAE），这种蛋白酶的主要特征是能够水解不溶性弹性蛋白，在医学临床主要用于高血脂症，防止动脉粥样硬化等疾病的治疗。也可用于肉类和水产加工中的嫩化。弹性蛋白酶属于基质金属蛋白酶中的第4族，它是由lasB基因编码，是一种胞外分泌型蛋白酶，它的基因编码区长1497bp, 一共编码498个氨基酸（aa），其中1-23位aa为信号肽，24-498位aa为前弹性蛋白，该蛋白在胞外分泌过程中通过细菌外膜后，在197位的His(H)与198位的Ala(A)之间，通过蛋白酶切割，靠近C-端的301个氨基酸残基都是具有活性的成熟蛋白^[1]。这种成熟蛋白分泌到胞外，能够降解病变的细胞外基质，并且在铜绿假单胞菌的感染中起着非常重要的作用。因此，获得纯化的弹性蛋白酶，对于研究其致病机理，具有重要意义。

弹性蛋白酶在医疗、食品工业、日用化学工业中具有较高的商业和应用价值^[2-4]。在医药产品方面，具有维持纤维血管正弹性的独特功能，对治疗高血脂、老年心血管病等症疗效显著；在食品工业上，利用弹性蛋白酶能降解许多动、植物蛋白，可作为嫩化剂, 因而它可用于农副产品的深加工以及高蛋白食品的生产制作，并取得了加工业等方面的普遍应用；在日用化学工业上，弹性蛋白酶能够起促进皮肤的血液循环，并且能够改善皮肤的脂质代谢，增强皮肤、毛发的弹性和延缓皮肤衰老，减少皱纹及色素在体内沉积，还能促进毛发的生长，可以有效的防止脱发、掉发^[5]。

我国的弹性蛋白酶通常是由用水提取动物的胰脏制备而得^[6]，或者通过直接从细菌培养上清中提取弹性蛋白酶，但是产量低、纯化困难，不能很好地满足研究工作和市场需要^[7]。现在我们试着利用微生物发酵表达，通过一系列生物化学手段来解决这一问题^[8]，利用基因工程技术来构建表达性工程菌从而制备较高纯度的弹性蛋白酶，这将非常有利于对PAE的进一步研究和开发。

通过查阅相关文献我们知道，外源基因能否成功表达的一个关键环节是选择合适的蛋白表达系统，而毕赤酵母是近几年新兴发展一种成功的表达异源蛋白宿主，在基础研究和生物技术工业领域已经应用了几十年之久，它是一种甲醇营养型酵母表达系统，和其他一些表达系统相比，该系统所具有着许多优点与优势使其具有很高的研究价值和应用价值^[9]，因此在本实验中我们选用毕赤酵母作为表达载体。

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