论文总字数：19727字

摘 要

转录基因在植物对外界应答和生长过程当中至关重要。WRKY转录因子具有一类高度保守的氨基酸序列WRKYGQK，植物N端特有的转录因子。WRKY转录因子首先是在甘薯中克隆的，之后也在大约20多种植物里面证实了WRKY转录因子的存在，并且阐述了对应的分子生物学功能。当前，人们在玉米中发现了大于一百个WRKY转录因子，在拟南芥中发现了大于七十个。研究阐明：WRKY转录因子可以和与其对应的顺式作用元件产生特异作用。这篇文章利用发布的玉米基因有关的数据，采用生物信息学的方法对玉米WRKY基因家族的结构、系统进化、保守结构域以及WRKY转录因子家族在玉米、短柄草、高粱和玉米的同源性关系进行了分析。通过研究，将为未来WRKY转录因子在植物中的进化分析奠定基础。

关键词：玉米；WRKY转录因子；生物信息学

Abstract:WRKY transcriptional gene families in the growth and development process of plant response to the outside world and plays an important role. WRKY transcription factors - unique to plants contain highly conservative amino acid sequence - N - end WRKYGQK class of transcription factors. WRKY transcription factor was first cloned in sweet potato, after about 20 many kinds of plants are also confirmed the existence of WRKY transcription factors, and expounds the corresponding molecular biology function. At present, found more than 100 people in the corn WRKY transcription factors, found more than 70 in arabidopsis thaliana. Studies clarify: can WRKY transcription factors and corresponding cis element to produce specific effects. Released this article USES the maize genome sequence data, using bioinformatics method for maize WRKY gene family structure, the structure of the system evolution, the conservative domain and the WRKY transcription factor family in maize, small grass, sorghum and maize homologous relationship are analyzed. Through the study, will be for the future analysis of WRKY transcription factors in plant evolution.

Keywords: Maize; WRKY transcription factors.;Bioinformatics

目录

1 引言 6

1.1 转录因子的概念 6

1.2 WRKY转录因子的来源 6

1.3 WRKY转录因子的结构特点 6

1.4 WRKY转录因子家族报道的研究 7

1.5 WRKY转录因子的功能 7

2 材料与方法 8

2.1 植物WRKY超家族转录因子的鉴定 8

2.2 蛋白序列的比对和玉米WRKY蛋白系统的进化分析 8

2.3 WRKY保守结构域的鉴定和分析 9

2.4 WRKY转录因子家族在玉米，短柄草，高粱和玉米中的同源性分析 9

3 结果和分析 9

3.1 玉米WRKY转录因子家族的鉴定 9

3.2 玉米WRKY转录因子家族的进化分析 12

3.3 玉米WRKY家族全长蛋白的结构性分析 14

3.4 玉米WRKY转录因子家族染色体复制分析 15

3.5 玉米WRKY转录因子在短柄草、高粱、玉米和水稻中染色体复制分析 16

结论 19

参考文献 20

致 谢 23

1 引言

1.1 转录因子的概念

转录因子（反式作用因子），它可以和基因启动子区域的顺式作用元件发生特殊反应。此外，它也可以激活或者抑制转录。典型的转录因子包含转录调控区、DNA结合区、核定位信号和寡聚化位点等结构。在植物中约有六十多个转录因子基因家族生存^[1] ，它是一类紧要的调控基因，在植物对外界反应以及生长发育进程当中至关重要，例如当前已被普遍研究的NAC、MYB和WRKY等转录基因家族。在植物里面，每个诱导型基因的表达大都是由转录水平所调控的,大多是家族的方式所表现的,每个转录因子便是在这个水准上起着重要作用的蛋白质,可以调节靶基因的转录,在信号传递和诱惑下面有关的功能基因表达中起至关重要的功能的转录因子。它在植物的体内组成多样化的调节结构, 在时间和空间上共同影响植物基因的表现。这些年来,在植物对生物以及非生物威胁的应答反应上,连续发现很多转录因子家族，在信号转递的水平上，调控基因的表达。如目前研究较多的WRKY 家族。

1.2 WRKY转录因子的来源

WRKY转录因子是一种新的转录因子，近年来一些植物特有的。它的命名由于它的N-端包含由一个非常守旧的氨基酸序列WRKYGQK。它最开始是在甘薯中克隆^[2]，以后也在大概20多种植物里面验证了具有WRKY转录因子，并且说明了对应的分子生物学作用^[3]。当前，人们在玉米中找到超过一百个,在拟南芥中找到七十多个。研究阐明：WRKY因子可以和相对应的元件W-box产生特殊反应。而W-box大多位于抗病性有关基因的区域。由此可知，WRKY转录因子基因与植物的生化功能密切关联^[4]。漫长的进化过程里, 虽然相同类型的转录因子的实力并非彻底一样,其和蛋白质作用的或者与DNA结合的结合域都是高度保守的。转录因子的差异大概是由一个结构域引起。

1.3 WRKY转录因子的结构特点

WRKY因子的DNA域中有最少一个WRKY域是其重要的布局特征，每个约六十个非常守旧的残基序列构成。WRKYGQK氨基酸残基是整个成员之间绝对守旧的,此外,一个非常守旧的基因内区是WRKY域编码顺序结构所具有的,它的存在不为人知^[5-6]。根据WRKY转录因子的结构特征,WRKY转录因子可以分为三类：第一类是包含两个WRKY结构域的WRKY转录因子,布局类型是C₂H2类型；第二类是只有一个WRKY域的WRKY因子，它的布局为C₂H₂类型；大多数WRKY因子只有一个WRKY域,所以,它都属于第二类;第三类WRKY因子也只有一个WRKY域,布局为C₂-HC类型。第三类WRKY因子只少许生活在高等植物中,低等里没有^[7]。同时,大约全部的第三种WRKY因子与植物的生理应激反应相关,表明它可能是由适应环境压制的演变。WRKY转录因子特异性辨别顺序是TTGAC片段(W-盒),大部分的WRKY因子上方控制顺序也有很多如此的辨别顺序。W-盒频率高于其他在病原体中的基因，参与诱导植物防卫反应。拟南芥里面,平均这些基因上方有4.1个 W-盒,随机选择中只有2.1个^[8]。WRKY对合并片段识别特异性很强,一个核苷酸突变(TTGACTTG-AA)将使结合活动显著减少甚至完全消失^[9]。体外实验表明,EDTA-Na₂可以完全抑制WRKY转录因子和DNA的结合,说明了含有锌指蛋白结构,但是没有直接的证据证明锌原子在其中的作用^[10]。

1.4 WRKY转录因子家族报道的研究

在一些作物中，大量文献报道WRKY转录因子参加了茉莉酸和水杨酸信号转导相关基因调控^[11-13]和抵抗疾病的性质。水稻WRKY45基因被验证与抗稻瘟病有关系,WRKY45的过度表达会增强水稻的抗稻瘟病。在拟南芥中，WRKY18,WRKY40和WRKY60基因与假单胞菌等菌的耐药性关系密切^[14]。近年来, 随着各种植物的基因组数据的公布, 使用一个特定基因的全基因组数据分析功能的家族越来越多。然后用生物信息学方法其报道他基因家族也越来越多, WRKY转录基因作为一种重要的基因家族, 一直是分子生物学研究的中心, 在拟南芥基因组的七十二个WRKY基因, 包含八十五个 WRKY域, 还有十三个 WRKY蛋白质包含两个WRKY域, 实验说明有一百零二个WRKY基因在水稻里^[15], 研究这些基因显著加快了解这类基因。

1.5 WRKY转录因子的功能

WRKY转录基因是植物独有的调控基因，对于目前来说，很多实验也只限于玉米，拟南芥和烟草等模式物种，它的功能研究也大多集中在抗病反应上。在已经有的数据库里面，发现了来自于很多植物的大于500个含有WRKY结构域的EST^[16]，SA或者病原菌对里面很多成员没有诱导作用。然而，随着越来越多的的高端技术的发明，专家发现，WRKY因子有生理和生化功能，能够调节植物的生长、发育和应对刺激。WRKY转录因子，尽管有少许一样的特点布局, 可因为其结构、顺式元件在序列及别的辅助功能成分的差异, 致使其成员在方向基因的生物活性和功能非常不同, 使家族广泛生活于各种组织, 参与许多代谢过程控制。现在的研究表明,WRKY基因在植物中不是一个类型的表达式, 而是由各种环境因素(如真菌诱导子,病原体)及其功能相似物、干燥、损伤、低温等各种非生物威胁和生物威胁, 它的表达具有组织特异性。

由于生物信息学发展，如拟南芥基因序列、短柄草、高粱和水稻模型的测定以实现，所以本文使用了以上的方法收集和鉴定了以上作物的WRKY基因序列，并且对它的同源基因进行了分析，探究其中的进化规律。本文以玉米WRKY转录因子家族为切入点，综合其他的模式作物的家族基因，使用发布的玉米等基因组草图数据，对玉米全基因组WRKY转录因子基因家族挑选，分析了WRKY转录因子的家族结构特征、进化情况、染色体的分布、在玉米自身以及在其他作物之间染色体的复制情况，讨论WRKY转录因子的数量并进行分类，并对体系发生学进行剖析和对比。该研究全面了解WRKY基因家族的信息和特点，对植物WRKY基因的克隆、功能鉴定具有重要意义。

2 材料与方法

2.1 植物WRKY超家族转录因子的鉴定

为了分析WRKY家族转录因子的功效，我们从植物TFDB数据库中下载了相关物种的WRKY转录因子超家族序列^[17]。这些基因组序列分别来自拟南芥基因组序列、玉米基因组序列、水稻基因组序列和高粱基因组序列。在得到相关物种的WRKY基因家族序列之后，最重要的就是是对WRKY基因进行鉴定。一开始，这些蛋白的结构域都通过Pfam程序 ^[18-19]进行分析，如果有一个WRKY结构域，候选蛋白属于WRKY蛋白家族，而不能检测出WRKY结构域，就不属于家族。其次，作为最终的序列质量刷选标准，我们把这些WRKY的保守区域用SMART软件进行分析^[20]。此外，针对玉米WRKY基因，我们从玉米RGAP下载与其相关的数据，利用软件进行分析。

2.2 蛋白序列的比对和玉米WRKY蛋白系统的进化分析

用ClustalW分析玉米WRKY的多序列比,WebLogo分析它的保守性^[21],Mega5构建进化树^[22]。我们对WRKY蛋白的保守区域主要采用邻接法来进行进化树的构建，1000次重复设置引导。

2.3 WRKY保守结构域的鉴定和分析

用MEME流程^[23]分析玉米WRKY结构域。参考数字设置为：(1) 基序反复的数目为“any”； (2) 基序的长度为6-200； (3) 预测基序的数量为25。

2.4 WRKY转录因子家族在玉米，短柄草，高粱和玉米中的同源性分析

WRKY基因在染色体的复制是用PGDD分析^[24],最后结果用MapInspect 进行构建。

3 结果和分析

3.1 玉米WRKY转录因子家族的鉴定

首先, 我们从NCBI中选序列结构域, 接着用Blastp程序,  在玉米基因组进行搜索，找出符合要求的WRKY基因。所有的序列，然后通过Pfam蛋白家族数据库来验证是否有一个WRKY结构域( Threshold= 0.9)。最后，根据分析的结果，进行序列筛选。最终获得了相关数据（表1)。对116个玉米WRKY基因的WRKY结构域氨基酸序列进行比对(图1),拟南芥、高粱，短柄草用相似的方法进行了分析。

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