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摘 要

本文研究了一种基于钾掺杂多壁碳纳米管-离子液体复合物用于测量细胞释放的超氧阴离子（O₂·^-）的电化学生物传感器。这种传感器能够在中性溶剂中进行催化氧还原产生很强的电流信号，很大程度提高了氧的检测灵敏度。然后，在不借助电子介质的情况下，通过监测SOD/O₂·^-之间酶促反应产生的氧气，将超氧化物歧化酶（SOD）混合到KMWNTs-[BMIM]PF₆凝胶中，制备了O₂·^-生物传感器。所得生物传感器的线性范围为0.04-38 μM，灵敏度高达98.2 μA mM^-1，检测下限为0.024 μM，过氧化氢（H₂O₂）、抗坏血酸（AA）、尿酸（UA）和神经递质的代谢物等常见干扰物质不干扰O₂·^-的检测。利用该生物传感器对肝癌和白血病细胞进行了体外O₂·^-测定，具有良好的生物电化学应用前景。

关键词：超氧阴离子 超氧化物歧化酶 癌细胞 掺钾多孔碳纳米管 离子液体

Abstract: A new electrochemical biosensor for measuring superoxide anion (O₂·^-) released from cancer cells in human body has been developed. The main material is potassium-doped multi-walled carbon nanotube ionic liquid composite. This sensor can be neutral. Catalytic oxygen reduction in the solvent produces a strong current signal, which greatly improves the detection sensitivity of oxygen. Then, by monitoring the oxygen generated by the enzymatic reaction between SOD/O₂·^- without using an electron medium, superoxide dismutase (SOD) was mixed into the KMWNTs-[BMIM]PF₆ gel to prepare O₂·^-biological sensor. The obtained biosensor has a linear range of 0.04~38 μM, sensitivity up to 98.2 μA mM^-1, detection limit of 0.024 μM, common interfering substances such as hydrogen peroxide (H₂O₂), ascorbic acid (AA), uric acid (UA) and neurotransmitter metabolites. Does not interfere with the detection of O₂·^- The biosensor was used to measure the liver cancer and leukemia cells in vitro, which has a good prospect of bioelectrochemistry.

Keywords: superoxide anion • superoxide dismutase • cancer cell • potassium-doped multi-welled carbon nanotubes • ionic liquid

目 录

1 前言 3

1.1 超氧阴离子简介 3

1.2 钾掺杂多壁碳纳米管-离子液体复合物简介 3

1.3 本课题的主要内容及意义 4

2 实验部分 4

2.1 试剂 4

2.2 设备 5

2.3 修饰电极的制备 5

2.4 细胞培养 5

3. 结果与讨论 6

3.1 KMWNTs和KMWNTs-[BMIM]PF₆复合凝胶的电化学性能 6

3.2 溶解氧的电催化还原 7

3.3 KMWNTs-[BMIM]PF₆-SOD/GCE的分析性能 8

3.4 测定HL-60和SMMC-7721癌细胞释放的超氧阴离子 10

结论 12

参考文献 13

致谢 15

1 前言

1.1 超氧阴离子简介

活性氧（ROS）包括超氧阴离子（O₂·^-）、过氧化氢（H₂O₂）、羟基自由基（OH·）、过氧亚硝酸盐（ONOO^-）等，导致蛋白质和核酸的氧化损伤，导致突变和细胞死亡^[1]。 O₂·^-，即所谓的活性氧的主要成分，在各种生物系统中作为大量分子氧的还原中间体生成。在正常生理条件下，O₂·^-的产生速率与组织分解它们的能力相匹配，因此保持了相当低且不可检测的内源性生理浓度。然而，发生在脑外伤、缺血再灌注和缺氧反应中的O₂·^-活性的增加^{[2, 3]}，超过了机体处理潜在细胞毒性物质的自然能力，可能与衰老、癌症和进行性神经退行性疾病（如帕金森氏病）的病因有关^[4-10]。此外，在Fe² 、Cu^{2 [11-13]}等过渡金属离子存在下，O₂·^-容易形成OH·并与NO反应生成ONOO^{- [14,15]}，这也与动脉粥样硬化和神经退行性疾病的发病机制有关。因此，超氧阴离子含量测定在细胞损伤的测定中具有重要意义，而一种选择性、灵敏、持久、可靠的超氧阴离子含量测定方法对于自由基生物化学和与超氧阴离子相关疾病的病理生理学研究具有重要意义。基于蛋白质直接电子转移的第三代超氧阴离子传感器由于具有良好的选择性和高灵敏度，为检测超氧阴离子提供了一种优雅的方法，其中超氧化物歧化酶(SOD)被广泛应用，但酶和电极之间的直接接触往往会导致细胞结构和/或功能的显著变化^[10]。为了挑战这些关键的分析问题，可以在还原的基础上监测酶产生的超氧阴离子。然而，由于传统电极上氧的电催化还原反应动力学较差，开发一种性能优越的新型材料用于氧的还原，开发一种具有微摩尔甚至纳米摩尔灵敏度的高选择性生物传感器，为跟踪超氧阴离子在生理和病理过程中的作用提供有关超氧阴离子浓度的定量信息，具有十分重要的意义。

1.2 钾掺杂多壁碳纳米管-离子液体复合物简介

钾掺杂的多壁碳纳米管（KMWNTs）可以提高碳纳米管在生物传感应用中的生物相容性和灵敏度。与多壁碳纳米管一样，钾多壁碳纳米管通常是组装成束，彼此严重缠绕，形成团块。这些结构方面使KMWNTs^[16]具有相对较差的机械和导电性能。为了改变它们的化学和物理性质，人们可以期望KMWNTs在复合材料上有更大的性能。有机阳离子通过所谓的“阳离子-π”相互作用可能与π-电子化合物相互作用^[17]。更重要的是，离子液体在绿色化学应用和电化学应用中有着巨大的前景^[18，19]，特别是由于其高稳定性、高电化学导电性和极低的蒸气压。而且溶解性广，有利于KMWNTs的分散。而且，离子液体中的反阴离子（如带负电荷的酶）具有很高的生物相容性和互换性，有利于生物分子的进一步固定化，因此，KMWNTs-离子液体复合物是一种非常有前景的材料，可用于电化学分析与生物分析。

1.3 本课题的主要内容及意义

本文中我们利用KMWNTs-[BMIM]PF₆-bucky凝胶作为氧还原反应催化剂，其在中性溶液中表现出了较强的还原信号。因此，它可以作为一种高选择性的超氧阴离子传感器，比未经修饰的电极具有更大的正电位（–0.3 V）。此外，我们还利用SOD修饰的KMWNTs-[BMIM]PF₆复合凝胶对氧具有良好的电还原性能，开发了一种高特异性的超氧阴离子传感器。该生物传感器具有制作简单、响应速度快、稳定性和重现性好、检测限低等优点。更重要的是，生物传感器对检测氧气有很大的好处，具有较高的选择性，不仅避免了一些共存的干扰，如AA、UA和一些神经递质的代谢物，而且还避免了更值得注意的干扰，即H₂O₂。开发的生物传感器被用于测量活细胞释放的超氧阴离子，这可能非常重要，因为越来越多的证据表明，生物系统释放的超氧阴离子可能在衰老、癌症和进行性神经退行性疾病（如帕金森氏病）的病因中起作用^[5-8]。

2 实验部分

2.1 试剂

多壁碳纳米管(MWNTs, 95%, d lt; 10 nm)来自于深圳市纳米科技港口有限公司（中国）；1-丁基-3-甲基咪唑六氟磷酸盐 ([BMIM]PF₆, 99%) 来自于上海成杰化工有限公司（中国）； 钾掺杂多壁碳纳米管来自本课题组；来自牛红细胞的超氧化物歧化酶（SOD，酶代码EC1.15.1.1）在美国西格玛市售。从Sigma–Aldrich（美国）获得葡萄糖（GC）、-抗坏血酸（AA）、尿酸（UA）、乳酸（LA）、谷氨酸（GA）和脂多糖（LPS）。吖啶橙（AO）和溴化乙锭（1% w/v，EB）购自美国阿姆雷斯科 从0.01 M的KO₂储备溶液中获得O₂·^-溶液，将1.41 mL二甲基亚砜（与分子筛4Å（Roth，Karlsruhe，Germany）一起储存)添加到1.0 mg KO₂中，超声5分钟，然后将额外的分子筛4Å放入溶液中以排除H₂O；所有其他化学材料均具有分析性质。在没有进一步净化的情况下用于实验；采用从Milli-Q净水系统中提取的超纯水制备水溶液。

2.2 设备

电化学分析仪（中国上海辰华仪器有限公司，CHI 660C）上进行了电化学测量。在0.1 M磷酸盐缓冲溶液（PBS，pH7.4）中进行线性扫描伏安法和计时伏安法测量，在0.1 M KCl溶液（含5.0 mM K₃[Fe(CN)₆]/K₄[Fe(CN)₆]）中，分别在室温（25±2°C）下，使用传统三电极系统进行循环伏安法测量。玻碳电极（GCE）作为工作电极，铂电极作为辅助电极，饱和甘汞电极（SCE）作为参考电极。

2.3 修饰电极的制备

将玻碳电极（GCE，d = 3 mm，ca.0.07 cm²）用细SiC纸打磨，用1.0和0.3 μm氧化铝浆打磨成镜面，分别在水中和无水乙醇中超声处理2 min，室温干燥。将KMWNTs（2 mg）悬浮于RIL([BMIM]PF₆)（0.4 mL）中，并用玛瑙研钵将混合物研磨15 min，其中悬浮液逐渐变成光滑的黑色糊状物。所得浆料在10000 rmp下离心30分钟，然后除去多余的液体，以分离凝胶相。然后，将KMWNTs-[BMIM]PF₆复合凝胶在预处理后的GCE上通过电极在凝胶上摩擦的方式进行包覆。每2 mg复合材料用0.5 mg SOD制备超氧化物生物传感器。首先制备复合凝胶，然后加入酶，再将凝胶混合15 min，然后通过在复合凝胶上摩擦电极将KMWNTs-[BMIM]PF₆-SOD复合材料涂在预处理的GCE上。为了获得均匀的薄膜，用抹刀进一步平滑涂层，并通过称重将改性量控制在0.5 mg。此外，在每次测量之前，用超纯水仔细冲洗修饰电极。

2.4 细胞培养

用修饰电极测定了人白血病（HL-60）和肝癌（SMMC-7721）细胞释放的超氧阴离子浓度。细胞在37°C的RPMI 1640培养基（GIBCO）中添加10%（V/V）胎牛血清（FBS，GIBCO），60 g青霉素，100 g链霉素在5% CO₂环境中生长。24 h后，收集细胞，以1000转/分的速度离心分离5分钟，然后用无菌PBS（pH 7.4）洗涤两次。将沉积物重新悬浮在PBS中，在一定浓度下获得均匀的细胞悬浮液。使用Petroff Hausser细胞计数器（美国）确定细胞数。对于O₂·^-检测，用50ng mL的LPS处理细胞0-96 h，然后离心分离细胞（10⁵ cells cm²），收集培养上清液，通过鼓泡氮气去除氧气进行O₂·^-分析。每个样本分五份进行分析。

3. 结果与讨论

3.1 KMWNTs和KMWNTs-[BMIM]PF₆复合凝胶的电化学性能

我们研究了KMWNTs-[BMIM]PF₆复合膜对电极界面处氧化还原探针的电子转移动力学，在含有5 mM K₃[Fe(CN)₆]/ K₄[Fe(CN)₆]的0.1 M KCl溶液中，KMWNTs-[BMIM]PF₆/GCE的循环伏安图如图1曲线E所示。峰值电流与MWNTs-[BMIM]PF₆/GCE（曲线d，图1）、KMWNTs/GCE（曲线c，图1）、MWNTs/GCE（曲线b，图1）和裸GCE（曲线a，图1）相比显著增加。KMWNTs-[BMIM]PF₆/GCE, MWNTs-[BMIM]PF₆/GCE, KMWNTs/GCE, MWNTs/GCE和裸GCE峰间电位差分别为82、85、90、92和93 mV。这些D_EP与峰电流变化的微小差异表明，KMWNTs-[BMIM]PF₆复合凝胶能有效地加速Fe(CN)₆^3–/4–与电极之间的电子转移。

图1.（a）裸GCE,（b）MWNTs/GCE,（c）KMWNTs/GCE,（d）MWNTs-[BMIM]PF₆/GCE和（e）KMWNTs-[BMIM]PF₆/GCE在0.1 M KCl溶液中的循环伏安图,该溶液含有5 mM K₃[Fe(CN)₆]/ K₄[Fe(CN)₆]。扫描速率:50 mV s^-1。

3.2 溶解氧的电催化还原

图2.（a）在（a）裸/GCE,（b）[BMIM]PF₆/GCE,（c）MWNTs/GCE,d）KMWNTs/GCE,（e）MWNTs-[BMIM]PF₆/GCE和（f）KMWNTs-[BMIM]PF₆/GCE的氧气还原的LSV,记录在0.1 M pH 7.4PBS的空气中.插图lKMWNTs-[BMIM]PF₆/GCE在0.1M pH 7.4氮饱和（a）和空气饱和（b）PBS中的LSV。

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