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摘 要

本实验是通过钒酸盐氧化法配制新的R1,R2试剂进行检测定标，样本靶值不断试验试剂的性能，研制直接胆红素检测试剂盒，对肝脏疾病和胆道梗阻进行检测，R²=0.9801，检测范围为0-6.84μmol/L (0-0.4mg/dl)，检测限的试剂空白吸光度（光径1.0cm，波长450nm）≤0.10，线性范围：0.5-342μmol/L，R²≥0.990，准确度的相对偏差应不超过±10%，精密度：重复性CV≤5%，批间差R≤8%，符合国家对体外检测试剂盒检测的标准。实验原理是：当PH在3左右时，样本中的总胆红素、直接胆红素能够在钒酸盐，打开溶液表面张力物质的作用下转换氧化成胆绿素。测定胆红素氧化前后吸光度的差,可以计算出标本中胆红素的浓度。^[1]

关键词: 直接胆红素; 钒酸盐氧化法; 黄疸疾病

Development Of Direct Bilirubin Detection Kit In Vitro

Abstract

In this experiment, new R1 and R2 reagents were prepared by the vanadate oxidation method for detection and calibration. The target value of the sample was continuously tested for the performance of the reagent, and a direct bilirubin detection kit was developed to detect liver diseases and biliary obstruction. R2= 0.9801, the detection range is 0-6.84μmol/L (0-0.4mg/dl), the reagent blank absorbance of the detection limit (optical path 1.0cm, wavelength 450nm) ≤0.10, linear range: 0.5-342μmol/L, R2≥0.990 , The relative deviation of accuracy should not exceed ±10%, precision: repeatability CV≤5%, inter-assay difference R≤8%, which meets the national standards for in vitro testing kits. The principle of the experiment is: when the pH is around 3, the total bilirubin and direct bilirubin in the sample can be converted and oxidized into biliverdin under the action of vanadate to open the surface tension of the solution. The difference in absorbance before and after oxidation of bilirubin is measured, and the concentration of bilirubin in the specimen can be calculated. ^[1]

Key words: Direct Bilirubin ; Vanadate Oxidation ; Jaundice Disease

目录

摘 要 I

Abstract II

第一章引言 1

1.1 直接胆红素体外检测试剂盒 1

1.2 直接胆红素试剂盒预期用途 1

1.3实验计划 2

第二章直接胆红素（DBIL）检测试剂盒的研制 3

2.1 黄疸 3

2.2 直接胆红素偏高的原因和危害 3

2.3检验原理 3

2.4直接胆红素的应用 4

2.5主要仪器与试剂 4

2.5.1主要仪器 4

2.5.2主要试剂 4

2.5.3中英文对照 5

2.6第一次配制直接胆红素（DBIL）试剂配方 5

2.7 第一次试剂准备 6

2.8 第一次自配直接胆红素试剂的检测 6

2.9第一次自配直接胆红素试剂的再次检测 7

2.10第一次自配直接胆红素试剂与ABM,迈克试剂比对检测 7

2.11三种试剂朗道质控靶值测定 7

2.12三种试剂血清样本测定 8

2.13第二次直接胆红素（DBIL）试剂的配方 9

2.14第二次试剂准备 9

2.15第二次自配直接胆红素试剂的定标测试 10

2.16第二次自配直接胆红素试剂的二次定标测试 10

2.17第二次自配胆红素试剂与ABM，迈克试剂比对 10

2.18三种试剂质控靶值测定 11

2.19三种血清样本测定 11

第三章自配DBIL试剂血清样本重复性检测 12

3.1体外诊断试剂稳定性讨论 12

3.2试剂老化稳定性检测原理 12

3.3试剂稳定性数据 12

3.4试生产第一次结果分析 13

3.5试生产第二次结果分析 13

3.6反应体系的选择 14

第四章总结 15

致谢 16

参考文献 17

第一章引言

1.1 直接胆红素体外检测试剂盒

能够对人体血清样本进行体外各类疾病的判定进行检测，根据实际所使用到的试剂，校准品以及质控品等配套使用的试剂检测判断疾病。该试剂的使用是根据样本在体外在生化仪上对试剂进行测定得出的结论来对疾病进行预判，预防和诊断等，这种试剂叫体外诊断试剂。^[2]而本实验的选题背景与意义是：胆红素校准品与本公司生产的直接胆红素检测试剂盒配套使用，用于临床检验实验室直接胆红素项目定量检测的系统校准。由于间接胆红素在肝内的UDP作用下跟C₆H₁₀O₇相结合生成的物质叫直接胆红素也叫结合胆红素。因为DBIL溶于水能与偶氮试剂发生反应后通过肾的相关作用转换成尿排出体外。胆红素的代谢主要作用在肝脏，分为肝细胞对血液中间接胆红素三方面的作用过程为摄取，结合和排泄这三个过程。^[3]血液中DBIL的含量升高，表明胆红素的排泄出现了故障，不能从肝细胞经处理后从胆道排泄出去。黄疸的诊断和鉴别现阶段主要通过使用体外诊断试剂对血清中直接胆红素含量的检测来判断的。本实验直接胆红素（DBIL）的制备采用的是钒酸盐氧化法，目前测定胆红素的方法大致有3种:第1种为传统的重氮法,此法操作简便,是现今大多实验室采用的常规方法,但其存在2点缺陷,一是重氮试剂不稳定,必须由亚硝酸钠和氨基磺酸临时合成,且最多只能用2 d^[4];二是通过一定程度的检测直接胆红素中的一部分间接胆红素能够参与反应会随着反应时间的延长致使测定结果不准。其原因是重氮试剂能在一定作用下与间接、直接胆红素间反应的特异性不佳导致的。第2种为氧化酶法,本方法的不足之处在于试剂的配置过于复杂不利于开展，正是该法特异性过于明显，干扰的东西少。第3种方法为该实验室用到的钒酸盐氧化法，该法较比其他方法优势在于试剂配置成本低，干扰因素对其影响少，还能够得到数据准确的结果。

配制好的缓冲液进行测试时，要通过实验测试的吸光度的值，为了达到想要的线性，对试剂配方中的原料进行不同厂家批号的试验判断实验中最后所用原料成分的可行性。

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