论文总字数：15439字
目 录
摘要 1
引言 3
1材料与方法 4
1.1样品采集及菌株分离 4
1.2真菌孢子形态学观察 4
1.3内生真菌作用初步测定 4
1.3.1平板对峙培养试验 4
1.3.2载玻片对峙培养试验 4
1.4对玉米种子发芽率、发芽势的影响试验 5
1.5油菜内生菌对玉米抗氧化系统的影响 5
1.5.1对玉米种子过氧化氢酶活性的影响 5
1.5.2对玉米种子过氧化物酶活性的影响 5
1.5.3对玉米种子多酚氧化酶活性的影响 5
1.6统计方法 6
2结果与分析 6
2.1油菜内生菌的分离试验结果 6
2.2油菜内生菌与玉米纹枯病原菌平板对峙培养结果 6
2.3油菜内生菌与玉米纹枯病原菌玻片对峙镜检结果 7
2.4油菜内生菌培养液对玉米种子发芽势与发芽率的影响 7
2.5油菜内生菌培养液对玉米苗抗氧化酶活性的影响 9
2.5.1对过氧化氢酶活性的影响 9
2.5.2对过氧化物酶活性的影响 9
2.5.3对多酚氧化酶活性的影响 10
3结论 10
4讨论 11
参考文献 12
致谢 14
油菜内生菌的分离及对玉米苗的抗病和促生作用研究
郑泽霞
.
Abstract:In order to study the endophytic fungi of biocontrol effect is promoting effect, this paperseparating 6 strains of endophytic fungi from rape, the measurements of the antimicrobial effect, by co-culture of flat and
slides confrontation culture, determinated the mechanism of antimicrobial activity of Endophytes,at the same time,measured the endophytic fungi on Maize Germination percentage of corn germination and the effects of antioxidant enzyme activity. The results showed that altogether 6 were isolated from the rape plant endophytic
fungi, having endophytic fungi of mustard greensseed against rhizoctonia blight effect, Rhizoctonia solani became
wilting, 6 strains of endophytic fungi medium to maize seed germination potential is increased by 11% and the activities of antioxidant enzymes and control a significant change. Results showed that secondary metabolites of endophytic fungi on maize sheath blight pathogen rhizoctonia well restricted growth, on corn seed germination was not affected, but can improve maize seed germination potential, while promoting the corn seedling elongation and thickening,it could induce maize seedlings defensive protection mechanisms enhanced.
Key words: mustard greens; endophytic fungi; maize;
引言
植物内生菌是一类可长期定殖于植物体内而不易受外界环境影响，应用前景十分广阔的资源微生物，植物内生菌能够产生具有抗病性、植物生长激素类似物等的次生代谢产物而使其具有抗病性、促生作用等等作用。植物内生菌是指那些生活在健康植物生活史的部分或整个阶段中各种组织和器官内部的细菌或真菌, 而被感染内生菌的宿主植物(至少暂时的)不表现出外在的症状[1]。研究发现内生菌也具有生物多样性，Anorld[2]等人分析了两种巴拿马中部雨林中的植物叶子中的内生菌，结果他们从83个健康的叶片上分离得到的内生菌居然能多达418个形态学种，其中基因型不同的分类元则至少有347个，充分体现了内生菌的生物多样性。抗生素是一类在低浓度下可以对微生物生长代谢产生影响的异源小分子化合物[3]，而植物内生菌产生的抗生素类物质则直接在植物体内转运，发挥防病作用[4]。产生水解酶类是植物内生菌的另一个重要生防机制，水解酶包含几丁质酶，葡聚糖酶等等可以降解病原真菌细胞壁的酶类,这些酶也能够防御其他致病因子，最终达到防病效果，除此之外，内生菌还可以通过产生植物生长调节剂,对植物的生长起促进作用[5]；与病原菌竞争营养物质，从而抑制病原菌生长；促进宿主植物生长或增强抵抗力[6]；Van Loon和Van Wees等人认为根内定殖的内生菌，可以诱导植物产生抗性，即诱导系统抗性[7-8]；内生菌产生的某些生物碱对植物病害也有防治作用，这些都是内生菌对植物病害的控制机理。有研究表明，植物内生菌在增强植物他感作用、宿主植物的促生作用、植物环境胁迫性的增强及抗病虫害等方面有重要作用，它的活性产物用于研制抗肿瘤、抗菌药物等方面的研究也有很大进步[9]。在植物内生真菌和宿主植物的共生关系中，内生真菌产生的多种具有生物活性的次生代谢产物会有重要作用，这些内生菌的促生作用、固氮作用和生防作用使得感染内生菌的宿主具有抗逆境、抗病害等优势，这是因为内生菌的数目多，种类丰富；内生菌与宿主植物的关系使得其中有价值的次生代谢产物大大增加以及人们对内生菌的研究较少，成功几率大[18]。最新研究显示分离自植物内生真菌的生物活性物质中51%是前所未知的新物质[19]，而只有38%的概率能从土壤微生物中分离得到全新的生物活性物质[20]。内生菌作为一个较新的研究领域，它的种类数量为研究提供了丰富的研究材料，对其进行深入研究具有重要意义。
据统计玉米已成为我国第一大粮食作物，2012年全国玉米产量为20812万吨，增产1534万吨，超过稻谷产量383万吨[17]。而玉米病害是造成减产的最主要原因，玉米纹枯病是玉米四大病害之一，其是由立枯丝核菌(属半知菌亚门真菌,Rhizoctonis solani)引起的世界性玉米土传病害[10]，是危害玉米的严重病害。该病会引起玉米近地面的叶鞘和茎杆茎基腐败，破坏输导组织，使得水分和营养的运输受到影响。目前对于玉米纹枯病的防治主要是利用化学药物进行处理，但是在植物保护中大量化学农药的施用已引起了严重的环境问题，并且容易使其产生抗药性，加大化学药剂用量更是一个恶性循环。生物防治是粮食安全生产以及环境保护要致力研究的焦点，是未来相当有前景的发展方向，内生菌次生代谢产物的抑菌作用也是当前国内外的研究热点，这也是因为植物内生菌生长在植物体内，具有稳定的生存空间，并且内生菌种类繁多，其中的有益内生菌所占比例也大，可以为人们的研究提供更多的样本对象，从而选择适宜的方式提高植物抗性，利于其生长发育。近年来人们已发现了60余种药理作用存在于微生物的次生代谢产物中[11]。植物内生真菌是在植物中度过部分或整个生活周期且能够使寄主不表现出任何症状的一类真菌, 内生菌也具有普遍性，几乎存在于所有植物体内[12]。本研究从十字花科油菜中分离内生菌，利用内生菌次生代谢产物与玉米种子及幼苗共同培养，以期研究内生菌对幼苗长势以及抵抗病害的能力等前期生长和抗性的影响，为粮食安全生产及生物防治提供参考依据。
1 材料与方法
1.1 样品采集及菌株分离
油菜内生菌的分离主要采用表面消毒法。油菜品种为秋田上海青，从市场购买；油菜品种为秋田上海青，从市场购买；采集幼苗作为试验材料 。将油菜苗用自来水流水冲洗半小时，用75%酒精洗涤5分钟，用 0.1% 升汞溶液浸泡10 min，不断搅动，再用无菌水洗涤 5 次。无菌条件下将油菜幼苗切段，分别置于 PDA平板培养基(含200 IU/mL青霉素)上，在25摄氏度下暗箱培养5天。取 0.1mL 最后一次清洗的无菌水涂布PDA平板作对照，以检查消毒效果，2至3天后若有菌落形成，则表明表面消毒不彻底，实验应当重做。准备好新鲜的 PDA 培养基，用于及时接种组织材料切口处长出的菌丝体，待菌落出现后分别挑取颜色、形态及生长速度不同的菌落边缘菌丝，转接于PDA 培养基平板(青霉素: 200 IU/mL)上进行再培养。对已纯化的菌株再次纯化，转接至 PDA 斜面培养基上，于25 ℃培养箱中培养 5天后放入4 ℃冰箱中保存。
1.2 真菌孢子形态学观察
从培养数天后的纯化的菌株上挑取菌丝制成玻片，在显微镜下观察菌丝形态，以及其有性或无性孢子形态，初步确定该内生真菌的分类地位。
1.3 内生真菌抑菌作用初步测定
选取纯化好的油菜内生真菌，进行液体培养，过滤菌丝，取其培养液用作抑菌液进行抑菌测定。
1.3.1平板对峙培养试验
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