论文总字数：19327字

目 录

摘要 I

Abstract II

1. 引言 1

1.1土壤微生物 1

1.2施肥对土壤微生物的影响 1

1.3 BIOLOG技术 1

1.4 恒温微量热法 2

2.材料与方法 3

2.1 实验概况 3

2.2 土壤样品采集 3

2.3 土壤的理化性质 3

2.4 BIOLOG实验 3

2.5 微量热实验 4

2.6 统计分析 4

3.结果与分析 4

3.1不同施肥处理中土壤微生物群落水平生理代谢活性 4

3.2 不同施肥处理中土壤热代谢活性 6

3.3 添加不同碳源后土壤微生物热代谢活性的变化 7

4.讨论 8

5.结论 9

参考文献 9

致谢 13

BIOLOG与微量热耦合研究有机肥对红壤微生物代谢活性的影响

陈美君

，China

Abstract：Soil microorganisms are important components in the soil. The research relating to soil microbial metabolic activity is vital for understanding the influences of agricultural management on the soil agro-ecosystems.The existing reports show that the application of organic fertilizers has positive impacts on elevating soil microbial activity using the techniques of BIOLOG and microcalorimetry.However,there is still lack of information on the stimulating mechanisms of organic fertilization. In this investigation, a typical acidic soil, red soil, was selected to investigate the effects of organic fertilization on variations in the sole carbon source utilization and heat emission characteristics by using BIOLOG and microcalorimetry, respectively.Furthermore, by combining those two techniques, we discussed the preferences of red soil to carbon substrates discerned by BIOLOG.Results showed that, the application of organic fertilizer could elevate the ability of carbon source utilization and heat evolution.By combining BIOLOG and microcalorimetry, it was found that the microorganisms in red soil preferred the substrates of L-arginine and glycogen,which might be the reason of the elevated microbial metabolic activity under the organic fertilization. Our research suggested that,the application of organic fertilizers abundant in L-arginine and glycogen might be conducive to the elevation of soil microbial activity and subsequently to the sustainability of red soil ecosystem.

Keywords：BIOLOG，microcalorimetry, fertilization, organic fertilizer

引言

1.1土壤微生物

土壤微生物是土壤中肉眼不可见或看不清楚的所有微小生物的统称，通常应包括细菌、真菌、古细菌、病毒、原生动物和显微藻类等（林先贵等，2008）。土壤微生物是土壤生态系统的重要组成部分，也是最为活跃的部分，是土壤养分转化和供应的重要调节因素（章家恩等，2000）。土壤微生物活动不仅对土壤环境质量的波动敏感，而且也是土壤生物活性的重要体现（叶存旺等，2007），与土壤中营养元素循环、有机物质降解等密切相关(Gomez 和Garland, 2012)。

1.2施肥对土壤微生物的影响

在农业生态系统中，外界环境（气候变化等）、农业措施（如施肥、灌溉等）均会对土壤微生物群落功能、结构多样性等产生影响(Mohammadi等, 2013)。研究表明，长期施肥会显著改变土壤的物理化学性质和生物活性（马宁宁等，2010),对可持续利用和土壤质量产生深远的影响。施肥对土壤微生物特性的影响越来越受到研究者们的重视，人们已经不再单单研究土壤性质，而是考虑了各种的因素。研究表明，施肥会显著改变土壤微生物群落结构（张奇春等，2010），长期平衡施肥会提高土壤微生物生物量碳氮和微生物活性（张志明等，2010）。申卫收等（2008）利用土壤酶学、可培养微生物技术研究不同施肥处理下的土壤微生物活性变化，结果表明不同施肥处理对土壤的脱氢酶活性和可培养放线菌数量有显著的影响，表现为施肥会提高土壤微生物群落代谢活性和功能多样性。此外，施肥会增加微生物生物量的氮、碳和土壤酶活性（沈宏等，1997）。

另外，相关研究表明，施肥，特别是施用有机肥对土壤微生物影响很大。Melero等（2006）研究表明，与施用化肥相比，施用有机肥能显著增加土壤中的土壤有机质、有效氮、有效磷含量，增强土壤呼吸。同时，有机肥的施用可以显著提高铵态氮含量和土壤总氮。林先贵等（2016）研究表明，对于我国华北地区的潮土，长期施肥，特别是施用有机肥可以大大增加土壤有机碳含量和养分含量，尤其是磷含量，从而改变了土壤的微生物群落结构，提高了微生物生物量碳、呼吸强度、转化酶活性以及微生物功能多样性(碳代谢活性)。Zhang等(2013)通过向土壤中添加有机肥料，研究得出有机肥能够使土壤微生物群落功能多样性和土壤微生物代谢活动的增加的结论。Sun等(2010)的研究表明，有机肥可以改善土壤的微生物量氮、碳和微生物对碳源的利用率，提高土壤肥力。

因此，通过研究土壤微生物结构及功能的变化可评价不同措施或环境对农业生产的影响(Hu等, 2011)。在土壤微生物功能方面，由于许多生物化学反应与之密切相关，相继发展了多种检测手段，例如通过测定土壤呼吸速率、基质诱导呼吸、脱氢酶活性、热代谢以及群落水平生理剖面等表征微生物代谢活性(Nannipieri等, 2003)。

1.3 BIOLOG技术

BIOLOG技术最早在上世纪九十年代用于鉴定纯种微生物，后来广泛应用于研究土壤微生物碳源代谢能力，用以表征微生物代谢功能(Zak 等, 1994)。例如，采用BIOLOG技术研究不同肥料种类、土壤类型、管理措施中碳源代谢能力的差异(Bronwyn和Raymond, 1997)。

BIOLOG技术的测定原理：微生物利用碳源生成的自由电子，和四唑盐染料发生还原显色反应，颜色深浅可以反映微生物对碳源的利用程度。由于微生物利用不同碳源的能力在很大程度上取决于微生物的固有性质和种类，所以通过同时测量一块微平板上的微生物对不同单一碳源的利用能力来鉴定纯种微生物或对不同微生物群落的比较分析（席劲瑛等，2003）。

BIOLOG是研究土壤微生物代谢活性的有用工具。但我们同时注意到，BIOLOG是一种可培养的分析手段，仅能表征土壤中很少一部分、且代谢较快的微生物（约1%）的活性，不能表征生长缓慢的微生物的代谢特征(Nannipieri等, 2003; Gomez和Garland, 2012)。这主要是由于在实验操作过程中一些操作，如稀释倍数、培养环境等会引起测定样品与原位土壤的差异，造成信息不完整或误读(Gomez和Garland, 2012)。因此，我们可以看出，BIOLOG技术不能完整地表征土壤微生物代谢能力，而且不能表征微生物群落的热代谢能力，所以我们需要采用其他技术对BIOLOG结果进行进一步甄别。

1.4 恒温微量热法

恒温微量热法是近年来发展起来的一种研究生物热力学与动力学的重要方法（刘晓梅等，2008）。这种生物学方法应用广泛，可检测固体、液态等不同类型的样品，不仅能够检测DNA，蛋白质等大分子的结构和变化，(Prado, 2011;Vazquez C, 2016, Braissant O, 2013)，还能够检测微生物代谢活性（刘晓梅等，2008）。通过拟合热动力学曲线获取相应的动力学参数，描述微生物生长的动力学特征（Wu等，2016），从而比较土壤微生物代谢活性(Rong等, 2007)。这种方法具有高灵敏度、可定量性、不改变土壤样品的性质、简单方便易于操作等特点(姜兰兰等，2016)，并且能提供持续、实时的、无干扰的监测(冯有智和林先贵, 2012)。已有研究表明，有机化学污染物、重金属、施肥种类等均对土壤热代谢活性有影响，其热动力学参数与传统的土壤呼吸速率、基质诱导呼吸、脱氢酶活性等密切相关(Braissant等, 2010; Braissant等, 2013)，因此其重要性引起越来越多的科学家的关注。微量热法一般采用葡萄糖和硫酸铵作为碳源（能源）及氮源底物，通过土壤微生物对该类底物代谢的热动力学特征来表征。但该技术具有非特异性，在判定土壤微生物代谢活性变化的因素方面存在局限性（Wadso, 2002）。而且我们发现BIOLOG及微量热技术在解释土壤微生物代谢活性方面具有共性。这给予我们的启示：能否通过微量热法验证BIOLOG实验中不同碳源的代谢差异，比较不同土壤中碳源偏好特征。

目前很多研究均单独地采用BIOLOG或微量热方法对土壤微生物代谢特征进行研究，鲜有报道涉及两种方法的组合以挖掘引起土壤群落代谢变化的原因。Xu等(2017)通过BIOLOG技术研究了潮土（碱性土）及中性偏碱土壤中微生物对某些碳源的偏好信息，揭示了引起微生物活性变化的关键碳源因子，获得较好的结果。但针对酸性土壤中的应用效果，目前缺乏相应的报道。因此本研究中选取一种典型的酸性土壤——红壤为研究对象，通过BIOLOG及微量热方法结合，研究施用有机肥后红壤微生物对碳源的偏好。红壤在我国占有很大面积，是一种重要的农田土壤，研究施肥对红壤微生物活性影响的关键碳源因子，对于农田管理、政策制定均具有重要的科学意义。

2.材料与方法

2.1 实验概况

旱地红壤采自于中国科学院鹰潭红壤生态试验站定位试验地（28°15′N，116°55′E）。该地区处于亚热带季风气候区，年平均气温为17.8℃，年均降雨量为1788mm，年蒸发量1318 mm，无霜期258d，成土母质主要为第四纪红黏土，种植的作物为花生（Arachis hypogaea）。定位试验始于2010年，设置三种不同施肥处理：不施肥处理（CK），单施无机肥处理（NPK），有机无机肥配施处理（OM），每个处理三个重复。在NPK处理中，N肥为尿素，P肥为钙镁磷肥，K肥为氯化钾，施用量分别为120 kg N/ha、170 kg P₂O₅/ha、180 kgK₂O/ha。在OM处理中，腐熟的稻秆堆肥施用量为3000kg/ha，并将N、P、K的施用量调整到与NPK处理一致的水平。所有的P、K肥及有机肥均作为基肥一次性施入，N肥则分成两次施用：基肥40%，追肥60%。

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