糖原对土壤微生物群落结构的影响

论文总字数：12446字

目 录

1、前言 1

1.1施用有机肥（有机碳源）的作用 1

1.2施用有机肥（有机碳源）对土壤微生物活性的影响 1

1.3施用有机肥（有机碳源）对土壤微生物群落结构的影响 2

1.4研究有机肥（糖原）对土壤微生物群落的影响的意义 3

2、材料与方法 3

2.1土壤样品 3

2.2实验设计 3

2.3土壤DNA提取及高通量测序 4

2.4统计分析 4

3、结果与分析 4

3.1 培养期间土壤CO2排放的变化 4

3.2 培养期间土壤微生物群落概况 5

3.3 培养期间微生物群落多样性变化 6

3.4 培养期间微生物群落结构变化 7

讨论与结论 8

参考文献 9

糖原对土壤微生物群落结构的影响

仇陆杰

，China

Abstract：Organic matter (organic carbon substrate) often severs as the important material to improve soil fertility and promote soil sustainable development. Previous studies have shown that glycogen can significantly increase the metabolic activity of P-deficient soil, but its effect on soil microbial community structure is still unknown. The object of this study was to study the influence of glycogen on the microbial community structure of a typical P-deficient soil, Fluvo-aquic soil in Henan Province, China. Four treatments were arranged: CK (control), CK glycogen（CKG）, OM (organic fertilizer ) and OM glycogen（OMG）, CO₂ emissions in soil were measured every week, and bacterial community composition was determined by high throughput sequencing. The results showed that the indices of community diversity were significantly changed by the glycogen addition. Moreover, the bacterial community structure was separated from the negative control. The dominant phyla in the control treatment were Proteobacteria, Acidobacteria, Actinobacteria, Planctomycetes, and Bacteriodetes. In contrast, the dominant lineages in glycogen treatments were Proteobacteria, Firmicutes, Bacteriodetes, and Acidobacteria. Principal component analysis revealed that glycogen treatment favored the propagation of the lineages affiliated to Rhizobium, Lysobacter, Pseudomonas and the unclassified Xanthomonas Chitinophagaceae, which might be one of the reasons for the improvement of soil microbial activity. Collectively, our study unraveled the underlying mechanism of glycogen-induced changes of soil bacterial community, which could provide the scientific basis for future organic fertilizer management.

Keywords: Glycogen; organic fertilizer; bacterial diversity; high throughput sequencing

1、前言

1.1施用有机肥（有机碳源）的作用

肥料在作物生长过程中充当着“粮食”的角色，对于促进粮食增产、保障粮食供应安全发挥着重要作用^[1]。化肥由于使用方便、增产效果明显而广泛应用于农业生产过程中，我国作为农业大国，化肥施用量常年位于全球第一，但肥料利用率不高，与发达国家存在较大差距。同时，化肥的过度施用也会带来多方面的负面影响，诸如导致土壤酸化、板结和土壤肥力下降，微生物活性下降等^[2]。随着国家对农业生态环境安全的重视以及社会环保意识的提高，减轻化肥造成的污染并保持农业可持续发展迫在眉睫，施用有机肥是解决该问题的途径之一。

有机肥中含有大量有机组分以及矿物营养元素，这些组分进入土壤后能改善土壤结构，调节土壤中的保水性、通气性、肥力和微生物活性。具体来说，有机肥在农业生产中发挥如下作用：一、改良土壤，维持地力。有机肥料进入土壤后，有机质可以有效地改善土壤理化状况和生物特性，培肥土壤并提高土壤保水能力，增强土壤保肥供肥能力和缓冲能力，为作物的生长创造良好的土壤条件。二、提高作物产量及品质。有机肥料含有丰富的有机物和各种营养元素，被降解后，一方面为微生物活动提供代谢底物，刺激微生物活性，调节微生物区系活动，另一方面还可以促进作物生长和提高作物抗逆能力。三、由于有机物质能吸附矿质养分，减缓养分的流失率，进而提高肥料的利用率^[3]。另外,有机肥在物质循环和环境保护上有重要作用，施用有机肥符合有机农业或生态农业的要求。

有机肥的原料来源丰富，有动植物残体、畜禽粪便、农业有机废弃物、餐厨垃圾等，其成分多样，对土壤生态系统的影响也存在差异。但目前对于有机肥，尤其不同组分，影响土壤生态系统的机理的理解，尚不透彻。

1.2施用有机肥（有机碳源）对土壤微生物活性的影响

微生物是土壤生态系统中重要的活性组分，它们参与土壤的有机物质转化及养分循环，对环境扰动响应敏感，被用作监测土壤特性和土壤环境变化的重要指示因子^[4]。表征土壤微生物活性的指标很多，有土壤酶活性、土壤微生物生物量、土壤呼吸强度、底物代谢活性等。

土壤酶活性与土壤养分循环状况密切相关，可揭示土壤的综合肥力特征以及土壤的养分转化进程，是监测土壤质量变化的敏感指标^[5]。例如，施用有机肥可以显著提高蔗糖酶和过氧化氢酶活性，同时随着有机肥施用量的提高，酶活性表现出显著增加的趋势；施用化肥则明显降低了土壤蔗糖酶和过氧化氢酶的活性；施用常量生物有机肥的土壤蔗糖酶活性与过氧化氢酶活性显著高于施用化肥。蔗糖酶直接参与了土壤有机质的代谢过程，可以作为表征土壤熟化程度和土壤肥力的指标。过氧化氢酶可以保护作物免受过氧化物毒害，与有机质降解紧密相连，其活性也被作为土壤肥力的指标^[6]。与此同时，由于有机肥中含有大量的有机组分，可作为蔗糖酶的代谢底物，进而提高酶活性。

土壤微生物生物量是表征土壤肥力的另一重要指标。土壤微生物生物量碳、氮、磷与相应的矿质营养元素循环密切相关，可用来表征土壤中活性较高的部分，其中微生物生物量碳因为其在土壤中含量最高以及较好的灵敏性，得到了较为充分的研究^[7]。施用有机肥对土壤微生物碳、氮的矿化和土壤呼吸有促进作用，，还可提高土壤有机质含量。由于有机肥同时会增加土壤活性炭以及活性氮的组分，刺激微生物活性，提高微生物生物量。

土壤微生物的底物代谢活性是表征土壤微生物活性的代谢指标。通过测定土壤微生物对不同碳源的利用情况，可以揭示土壤微生物对不同碳源的偏好^[8]。在长期施用有机肥的处理中，土壤微生物的碳代谢能力显著增强，同时还被诱导对一些碳源如精氨酸等产生偏好。此外，由于微生物在代谢过程中会产生热量，通过监测代谢过程中散热量变化，可以揭示土壤微生物的代谢活性高低。借助微量热技术，我们发现，施用有机肥后可显著提高微生物的代谢活性，进而说明施用有机肥对提高土壤物质转化功能具有重要作用。在此基础上，我们结合BIOLOG方法及微量热技术发现，在不同土壤中，通过碳源代谢活性揭示出的微生物碳源偏好性具有一定的局限性，例如，在红壤中显示偏好L-苏氨酸，D-甘露醇等，而在潮土中显示偏好α-D-乳糖等，导致这种差异的部分原因在于BIOLOG技术本质上是一种基于可培养的研究手段，其只能表征可培养微生物的生理代谢偏好性，而众所周知，环境中绝大多数微生物是不可培养的，但通过结合微量热方法可以克服这种片面性，我们对这些偏好性碳源进一步甄别，最终发现在红壤及潮土中，糖原对该类型土壤微生物代谢活性促进作用最明显^[9]。但目前，有关糖原对微生物群落影响的机理尚不明确，有待进一步研究。

1.3施用有机肥（有机碳源）对土壤微生物群落结构的影响

施用有机肥不仅对土壤微生物活性产生影响，同时会改变土壤微生物群落结构。有机肥为土壤微生物的活动提供能量和代谢底物，刺激微生物活性和区系平衡，优化土壤微生物群落的结构和功能^[10]。施用有机肥既可以通过影响生物化学特性，引起土壤微生物活性和土壤微生物群落结构的改变，也可以通过改变土壤的物理特性，从而间接影响微生物群落结构。多样性是衡量土壤微生物群落结构稳定性的重要指标之一，通过比较不同环境下的微生物多样性状况来反映土壤生态环境和土壤胁迫对微生物群落的影响^[11]。多样性高的微生物群落结构不仅表征微生物群落活性和稳定性较高，而且对不利环境条件具有较高的抗逆性。由于有机肥能够为土壤微生物提供相对平衡的代谢底物，因而可提高土壤微生物多样性以及生物群落的丰度。在农田生态系统中，有机肥还可以促进根系生长，改善作物抗病性，作物根系分泌物又可促进微生物繁殖^[12]。目前研究土壤微生物群落结构及多样性的方法很多，其中分子生物学手段和分子生态方法的发展极大地推动了土壤微生物响应机理的研究，例如DGGE/TGGE (变形梯度凝胶电泳/温度梯度电泳)和T-RFLP (末端限制性片段长度多态性)、PLFA（磷脂脂肪酸）等分子标记技术^[13]。近年来高通量测序技术迅速发展，它能在更高精度、更大通量上对土壤微生物群落结构进行研究，为研究土壤微生物群落的微生物学机制提供了强有力的技术力量和方法支撑。

1.4研究有机肥（糖原）对土壤微生物群落的影响的意义

已有研究大多集中在有机肥施用与土壤微生物群落结构，由于施用有机肥通过增加有机碳组分的供给而提高土壤微生物活性、优化土壤微生物群落结构，所以目前针对特定有机组分对土壤的微生物群落的影响缺乏研究。我们先前研究表明，长期施用有机肥后，土壤对糖原等有机碳组分产生偏好，并进一步通过BIOLOG及微量热技术发现，糖原对缺磷土壤（如河南封丘潮土）的微生物代谢活性影响较大，显著提高该土壤中热代谢及碳源代谢能力。由于糖原与土壤中磷素代谢相关，且封丘潮土属于典型的缺磷土壤，因此我们推测糖原可能通过改变土壤中微生物群落结构而改变代谢活性。但目前国内外缺乏相关研究。在本研究中，我们基于该结果，进一步研究糖原对潮土中的微生物群落结构的影响。该研究能加深糖原在潮土中提高土壤微生物活性的理解，对将来优化有机肥施肥方案、调控土壤微生物学过程提供理论依据，具有重要的科学价值和生态环境意义。

2、材料与方法

2.1土壤样品

供试土壤采集于河南省封丘市（35° 04′ N, 113° 10′ E），该地区位于黄淮海平原内，土壤类型为清壤质黄潮土，该区的气候属于半干旱、半湿润的暖温带季风气候，年平均降水量为650 nm，年平均温度为13.9℃。潮土农田生态系统养分平衡长期定位施肥试验开始时间为1989年秋季，采用夏玉米--冬小麦的轮作方式。试验开始时土壤各种养分相对贫瘠，有机质 5.83 g/kg，全N 0.445 g/kg，全P 0.50 g/kg，全K 18.6 g/kg，速效N 9.51 mg/kg，速效P（以P₂O₅计）1.93 mg/kg，速效K（以K₂O记）78.8 mg/kg，和pH 8.65，土壤总体上呈缺N、P而富K的状态^[14]。采集该试验地长期不施肥（CK）及施用有机肥（OM）处理潮土用于以下室内培养实验。

2.2实验设计

将采集的土壤，风干磨细过2 mm筛。设置四个处理，每个处理四个重复：（1）对照组（CK）；（2）对照 糖原（CKG）；（3）对照 有机肥（OM）；（4）对照 有机肥 糖原（OMG）。

具体实验步骤如下：

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