摘 要

氟喹诺酮作为一种预防和治疗细菌性感染的抗生素药物，因其抑制或者杀灭微生物的能力强，而被较多运用于畜禽水产养殖中的疾病防治。但是，目前有一些养殖户不合理甚至非法使用氟喹诺酮类药物，然后将没有经过合理的休药期的畜禽水产进行出售,导致产品中氟喹诺酮残留过量。因此，本文就氟喹诺酮类药物残留量检测方法进行了国标检测方法与ELISA方法进行比较：①液质检测时间：样品前处理时间约10h，检测时间约2h；②ELISA检测时间：样品处理约2h，检测时间约3min；结论：液质方法准确可靠，具有法律效力，但是实验时间长，操作复杂繁琐；ELISA法，实验步骤简单，检测时间较少，但实验过程容易被干扰出现假阳性。因此，“氟喹诺酮类”药物检测可以先通过ELISA法进行初筛，然后用液质的方法进行验证。

关键词：氟喹诺酮 液质 ELISA 准确性 检测

Comparison of Commercial Envoxacin Drug Residue Enzyme - linked Immunosorbent Assay Kit

ABSTRACT

Fluoroquinolones as an antibiotic drug for the prevention and treatment of bacterial infections, Because of its ability to suppress or kill micro-organisms, and are more used in livestock and poultry aquaculture disease prevention and control. However, there are some farmers are unreasonable or even illegal use of fluoroquinolones, and then will not have a reasonable period of off the sale of livestock and poultry aquatic products, resulting in excess product fluoroquinolone residues. Therefore, this article on the fluoroquinolone residues in the detection method of the national standard detection method and ELISA method for comparison: ① liquid quality detection time: sample pretreatment time of about 10h, detection time of about 2h; ② ELISA test time: sample treatment about 2h, detection time of about 3min; Conclusion: The liquid quality method is accurate and reliable, and has the legal effect, but the experiment time is long and the operation is complicated and complicated. ELISA method, the experimental steps are simple, the detection time is less, but the experimental process is easy to be disturbed false positives. Therefore, the "fluoroquinolones" drug detection can be first screening by ELISA method, and then use the liquid method to verify.

Key Words:Fluoroquinolones HPLC－MS/MS ELISA accuracy detection

目录

摘要 I

ABSTACT II

第一章文献综述 1

1.1氟喹诺酮 1

1.1.1．氟喹诺酮类药物的介绍 1

1.1.2．氟喹诺酮的理化性质及作用机理 1

1.1.3．氟喹诺酮类药物在机体内代谢机制 2

1.1.4．氟喹诺酮类药物的危害 3

1.2．氟喹诺酮类的检测方法 3

1.2.1微生物检测法 3

1.2.2高效液相色谱法 3

1.2.3色谱－质谱联用法 4

1.2.4免疫检测法 4

1.2.5其他检测方法 4

1.3．本课题采用的氟喹诺酮类药物的检测方法 5

1.3.1.HPLC－MS/MS法优缺点 5

1.3.2.ELISA快速检测法优缺点 5

1.4.氟喹诺酮类药物检测的重要性 5

第二章实验部分 7

2.1实验试剂和材料 7

2.1.1液相色谱-串联质谱法 7

2.1.2ELISA快速检测法 7

2.2实验仪器设备与条件 7

2.2.1液相色谱-串联质谱法 7

2.2.2 ELISA快速检测法 9

2.3实验方法 9

2.3.1液相色谱-串联质谱法 9

2.3.2酶联免疫快速检测（ELISA） 18

第三章结论与展望 21

3.1结论 21

3.2展望 22

参考文献 23

致谢 25

第一章文献综述

1.1氟喹诺酮

1.1.1．氟喹诺酮类药物的介绍

氟喹诺酮类药物属于抗生素，他是在喹诺酮的基础上分别在6位和7位分别引入氟和哌嗪环而得到的一类衍生化合物。喹诺酮类药物因其具有抑制微生物范围广、对动物机体毒害小，并且能够很好的研究此类药物在体内的动态变化规律等特点，而被作为畜禽和水产防治疾病的专用药物。氟喹诺酮类抗生素能与微生物的解链酶中的回旋酶α亚基结合，达到抑制甚至灭活内切酶与连接酶的活性，导致酶丧失其本身的切割功能无法产生粘性末端，同时，连接酶也无法发挥自身的连接功能，最终阻止了细菌脱氧核苷酸的复制，而呈现其独特的抗菌作用。此类抗生素抑制微生物范围广以及有很强的渗透性，喹诺酮类抗生素其最大特点是：它抑制革兰氏阴性菌效果明显，虽然对革兰氏阳性菌作作用较弱，但对部分的阳性菌效果也相当显著。该类药物被机体吸收后在血浆内的总浓度浓度较高且稳定，能广泛分布于组织中，并且有些喹诺酮类药物其代谢产物，也有很强的抗菌作用。因此，它对水生动物所有致病来源的微生物抑制率较大；对由氟喹诺酮类药物产生抵抗性能的致病细菌引起的严重的炎症也有很好的疗效，虽然致病来源的微生物对之前接触过与喹诺酮类药物有一定的记忆，但在使用此类药物能够不显示出抗药性。喹诺酮类药物这一优点说到了受到各个医药行业的高度关注，因此，在临床上它也已经被广泛应用。

1.1.2．氟喹诺酮的理化性质及作用机理

喹诺酮类药物为一般呈现出色泽微微泛黄，有时也会呈现出类白色，细微的晶体粉末,没有气味,味道略略泛苦。在碱性溶液中能够轻易被溶解,在水和甲醇中溶解度较小,同时它不能够与乙醇相溶;储存该类药物时应避光，在光照情况下易变色。氟喹诺酮对革兰氏阴性菌有很强的抑制作用，在众多抗生素共用的情况下能够，它能够不与其他类抗生素产生交叉的抗药性,因此喹诺酮类抗生素被广泛应用于各种畜禽水产的养殖中。氟喹诺酮顾名思义，它是在喹诺酮原有的分子结构的上引入了氟原子,这样的引入增强了此类抗生素药物与细菌体内靶细胞的相似相容性，同时增强氟喹诺酮在组织细胞中的跨膜运输能力，达到增加了抑制细菌的效果。在氟喹诺酮类药物中有些药物的代谢物产物也能够发挥抑制病菌的能力。例如恩诺沙星在机体内经过一系列的反应，代谢产物为具有很强的抑制细菌活性的环丙沙星，这样使得该类抗生素在体内有双重抗菌作用，在裂解和灭活细菌的效果上较之其他药物更好[1]。

1.1.3．氟喹诺酮类药物在机体内代谢机制

不管是内服还是肌肉注射喹诺酮类药物，它都能够被动物机体快速的吸收。使得血液和组织的药物浓度峰值远远大于绝大多数微生物细胞膜所能承受的浓度范围。同时，喹诺酮类药物在机体内消除较慢，停留时间较长，也能较快地分布到机体各处[3]。由此可见，喹诺酮类药物在生物体内分布广泛与生物高分子有大量结合。这里以恩诺沙星为例，查阅相关资料可得：恩诺沙星具有极好的抗菌能力，主要归功于它的代谢产物环丙沙星在其中发挥极大的作用的[4]。但是由于物种间的差异甚至个体见得不同以及获得药物的方式不同,血液中可检测到环丙沙星的浓度也是有高有低。恩诺沙星在动物体内转化为环丙沙星的比例取决于摄药动物的种属，例如在畜禽等物种中,恩诺沙星转化为环丙沙星比例较大且能继续在机体内发挥抑制甚至灭活微生物的作用,但在水产中恩诺沙星也能够代谢产生较多环丙沙星，但其中具有抑菌活性的却是寥寥。环丙沙星虽然优点多多，但机体如果接触此类药物,会引起体内病菌对抗生素产生耐药性,变异为超级细菌，这又将是人类的一次灾难。因此，权威机构已经不允许养殖业使用该类药物[5]。

1.1.4．氟喹诺酮类药物的危害

虽然，喹诺酮类药物早已经不能够使用与养殖业，但在利益的驱使下，仍有一些不法商贩给畜禽及水产喂食含有氟喹诺酮类饲料，有时甚至直接投食药物防止动物生病。然后又没有通过正常的时间,让药物在体内完全或者大部分地代谢，引起了产品中氟喹诺酮类残留超出了最大限值。这不仅会造成类身体健康问题，也很容易引起环境污染问题，不利于社会的健康稳定发展的要求。普遍以为氟喹诺酮类抗生素不会在动物组织内停留太久,但也有资料表明如果使用药物的剂量偏大时会有一定的富集性，此类抗生素毒性主要针对的是肝脏与肾脏[6]。氟喹诺酮类药物属于亲脂性抗生素，因此，它很容易在生物机体的脂肪层蓄积，然后通过食物链的过程进入人的体内逐渐积累最终引起人类的健康问题。氟喹诺酮类药物对人体的各种毒副作用，因此，相关权威机构也对人体每日允许摄取量也有严格的规定，一旦每日摄入量超过规定将会对人体有极大的危害。

1.2．氟喹诺酮类的检测方法

1.2.1微生物检测法

微生物检测法作用原理机制是利用细菌接触氟喹诺酮这类兽药后产生的一系列反应情况来检测此类兽药残留量的一种方法〔8〕，而且此种方法能够与仪器的检测方相互补足使得结果更加精准。利用特别的手段晒栓出相应的指示菌〔9〕，选增对应的显色剂，在细菌代谢过程中产生还原剂使得实验中产生肉眼可见颜色，可直接通过颜色来辨别样品是阳性还是阴性〔10〕。在操作过程正确的情况下，若实验结果为红色则刻判定样品为阳性，若结果为物色则样品为阴性即氟喹诺酮含量不超。当然，此类方法结果还需要采用ELISA方法或者液质的方法进行验证，是结果更加准确可靠。也可用其他微生物作为指示剂，通过测量抑制微生物范围来建立检测氟喹诺酮残留的另一种微生物检测法〔11〕。这类方法要求也更加的严格，菌株对培养基的酸碱度要求较高，这能够挺高检测方法的林敏度，这样才能够能够满足相关规定对氟喹诺酮残留量的检测要求。

1.2.2高效液相色谱法

高效液相色谱法（HPLC）能够区别于其它检测方法，具有相当高的灵敏度、检测时该方法有针对行，不会受到其他离子因素干扰、即便检测限，也能够被检出。水产品中氟喹诺酮含量检测用的最多的就是该方法。该方法大多数情况下用硅胶作为层析的分离柱即固定相起到吸附分离作用，利用有机溶剂、酸性溶液和离子对相结合的试剂作为载体〔12〕。然后建立反向分配固相萃取方法同时对动物源性组织中多种该类药物残留量进行检测〔13〕。

1.2.3色谱－质谱联用法

该方法是将高效液相色谱仪与质谱仪串联在一起，使二者相辅相成，形成一套检测能力极强的系统。随着各项科学技术的不断更新发展，色谱-质谱连用技术也在得到日益进步与完善，在LC－MS联用技术快速发展的同时，对氟喹诺酮类药物残留量的检测要求也在不断地提高。目前该方法主要向着高灵敏度和更加低检出限方向发展，并且能够同时检测多种喹诺酮类药物残留量〔14〕。

1.2.4免疫检测法

免疫分析方法的独到之处在于，它能够充分利用抗原与抗体之间具有严格地选择性即特异性结合反应，换言之，该法利用单克隆抗体对氟喹诺酮类药物有极强的感应能力〔15〕，结合现在先进的检测手段，形成一套独特的检测方法并对残留物质进行特异性分析的方法。免疫性检测方法操作简介易行简、检测结果迅速产生、方法具有特异性、检出限较低、能够同时分析大量样品且设备小巧易放置。现在科学的检测方法正向着快速、精准、便捷、高效的方向发展，该方法完全符合现代科学的发展节奏，因此免疫检测法也在日臻完善〔16〕。

1.2.5其他检测方法

在食品安全检测技术研究领域，分子印迹技术已经成为当下关注焦点，而且它与其它检测方法相比具独特的优点。因而，它能够被广泛应用在食品安全分析检测中，表面增强拉曼散射技术顾名思义，它是在原有拉曼光谱技术的基础上演变更新而来的。此项技术不仅能给出所检测试样的具体分子构造信息，还能够使得检测限达到单分子水平〔17〕-〔18〕。利用现在先进的毛细管电泳色谱柱法，建立了氟喹诺酮类药物残留的毛细管电泳检测方法〔19〕。该方法极大程度地完善流动相所需的各种条件，例如pH、离子浓度等。此方法实验结果显示，在各种条件最优的情况下他的检出限远远地狱其他同类的方法，这也为氟喹诺酮类药物残留检测提供了新的检测发展方向。通过实验，利用表面增强拉曼散射检测方法对氟喹诺酮类药物残留进行研究，但在一定浓度范围内氟喹诺酮类药物在拉曼光谱的特征峰没有明显增强，所以表面增强拉曼散射法检测水产品中氟喹诺酮药物残留还存在一定的局限性，若想该方法更加准确可靠还需进一步研究完善来弥补其中的不足。

1.3．本课题采用的氟喹诺酮类药物的检测方法

本文将采用国标液质的方法与ELISA快速检测方法进行对比，从而制订一套更加快速、高效的筛选方法，同时利用HPLC－MS/MS法再进一步精确检测。

1.3.1.HPLC－MS/MS法优缺点

HPLC-MS/MS方法拥有强大的掩蔽干扰物质的能力，检测的灵敏度高，在前处理过程中不需要过多的去除干扰物制，还能够在同一次检测中检测出常用的氟喹诺酮类药物。随着科技的不断发展更新，质谱仪也在不断地完善与普及，HPLC-MS/MS显然是检测氟喹诺酮药物残留的最优的检测方法。但是，此方法前处理与上机消耗时间较长,导致劳动力消耗也较大，而且检测的设备试剂成本较高，处理样品过程使用有机试剂对环境有一定的污染，而且它并不适合用于大规模检与筛选。

1.3.2.ELISA快速检测法优缺点

ELISA快速检测法运用抗原抗体特异性结合反应的原理,能快速对氟喹诺酮类药物残留量高效地筛选及作出定量分析,一般不需要繁琐复杂的前处理过程、实验操作简单、设备检测成本低、产生结果周期短。实验从实验开始到结束只需2h左右,而且能够同一个样品一次做多个平行实验,ELISA方法检测费用远低于液质方法，在大量样品快速检测中展现了独特的优势。但是受自身抗体、嗜异性抗体，仪器和手工操作等影响因素较多，存在很多的不确定性，这些不确定因素每个条件不稳定都会导致结果出现假阳性。

1.4.氟喹诺酮类药物检测的重要性

由于动物性食品中的兽药残留一直存在，这个问题日益受到国际社会的广泛关注,全球都在加强进出口动物性食品中兽药残留尤其是抗生素的严格检测。因此,为了人类舌尖上的安全即保障消费者身体健康,促进国际贸易的顺利开展,制定水产及畜禽肉中氟喹诺酮类药物的检测限值具有重要的重要的社会意义。目前,国内外在食品安全检测方面，检测兽药这类抗生素的检测方法多种多样，有的像液质方法一样，样品前处理复杂，步骤繁琐，实验消耗时间长，不适合有关部门在大批量检测中进行检验筛选；也有像竞争酶联免疫法运用抗原抗体特异性结合反应的原理,能快速对兽药作出检测分析及快速筛选,检测时间有较大的缩短。兽药检测任务繁重，检测方法也需要极大地，目地是为了更准更快检测喹诺酮类抗生素的残留量，也是为了更好的保障人类的身体健康。

第二章实验内容

2.1实验试剂和材料

2.1.1液相色谱-串联质谱法

水：经过滤水装置处理过的去离子水；乙腈:纯度符合HPLC级要求；冰乙酸：纯度符合HPLC级要求；正己烷：纯度符合HPLC级要求；甲酸：纯度符合优级纯要求：乙腈饱和的正己烷；2%甲酸溶液；甲酸-乙腈溶液（2 98，体积比）；7种喹诺酮类标准品的纯度不小于99%：7种喹诺酮类混合标准添加溶液：100ng/ml；

2.1.2 ELISA快速检测法

正己烷（分析纯）；乙腈（分析纯）；氢氧化钠（分析纯）；去离子水；包被有氟喹诺酮抗原的酶标板；氟喹诺酮标准溶液：0号：0μg/ml；1号：0.1μg/ml；2号：0.3μg/ml；3号：0.9μg/ml；4号：2.7μg/m；5号：8.1μg/ml；11×氟喹诺酮浓缩酶标抗体工作液；氟喹诺酮酶标抗体稀释液；20×氟喹诺酮浓缩洗涤液；10×氟喹诺酮浓缩样品复溶液；氟喹诺酮底物溶液A；氟喹诺酮底物溶液B;终止液；封板膜；

2.2实验仪器设备与条件

2.2.1液相色谱-串联质谱法

配有电喷雾离子源的高效液相色谱-串联质谱仪；高速组织捣碎机；旋转蒸发仪；氮吹仪(ANPEL)；涡流混匀机(VortexMixer)；离心机；分析天平（Sartorious）；移液器：200μL，1ml,5mL；棕色鸡心瓶：100ml；聚四氟乙烯具塞离心管：50ml；分液漏斗:125ml；一次性注射式滤器:配有0.45μL微孔滤膜；样品瓶：2ml，带聚四氟乙烯旋盖；

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