摘 要

海藻糖是由两个D-葡萄糖分子以α-1,1糖苷键链接起来的一种非还原性二糖。因为其在极其恶劣的条件下能够在生物体细胞，生物大分子表面形成一层特别的保护层，从而对生物体细胞和蛋白质起到保护作用，因此被科学界广泛研究。另外，海藻糖以其独特的生物性能，在多个领域方面都拥有着广阔的运用。目前，工业生产中工艺最简单的海藻糖生产方法方法为：以麦芽糖为原料，通过海藻糖合成酶（Trehalose synthase，简称TreS）一步催化生成海藻糖。这项工艺的重点在于拥有高转化率和高适应性的TreS。但是，目前已被研究和应用的TreS有转化率低，温度、pH耐受性差，副产物得率高等缺点。

本文的主要研究内容具体如下：以弯曲高温单孢菌（Thermomonospora curvata）海藻糖合成酶（简称：tcTreS）的三维晶体结构为基础，基于结构分析，在活性中心附近，我们根据侧链基团的大小以及氨基酸的亲疏水性分别设计了Y221A、Y221G、N261A、N261G、L331A、L331G、E334A、E334G这些突变体，对突变体进行酶活检测，发现只有底物通道中的Y221A和N261A突变体酶活有略微的提高，其余突变体酶活都有很大程度的减小甚至是失活。

关键词：海藻糖；分子工程；海藻糖合成酶；定点突变

Study on Site - directed Mutation Transformation of Trehalose Synthase

ABSTRACT

Trehalose (1-α-glucopyranosyl-1-α-glucopyranoside) is a non-reducing disaccharide formed of two D-glucose molecules by α-1,1 linkage，and it is a stable and non-reducing disaccharide with significant biological functions in various organisms. Because of its extremely harsh conditions in the biological cells, biological macromolecules on the surface to form a layer of special protective layer, so as to protect the biological cells and proteins, it has been widely studied by the scientific community.In addition, trehalose with its unique biological properties, in a number of areas have a broad use.Until now, among all the trehalose production methods, the simplest process route is using trehalose synthase (TreS) to catalyze maltose into trehalose by intermolecular transglycosylation. At present, there are many TreSs indentified from different microorganisms. However, only a few TreSs have the industrial application potential resulted from the low conversion rate, poor temperature, pH tolerance, high byproduct yield and many more.

The main contents of this paper are as follows: Based on the structural analysis, Threr are several substrate channel region residues near the active center. We selected Y221A, Y221G, N261A, N261G, L331A, L331G, E334A, E334G mutants according to the size of the side chain groups and the hydrophobicity of the amino acids. The mutants were tested for activity. Only the substrate Y221A and N261A mutant enzyme activity is slightly improved, the rest of the mutant enzyme activity has a large degree of reduction or even inactivation.

KEYWORDS: Trehalose；Molecular engineering；Trehalose synthase；Site-directed mutagenes

目 录

摘 要 I

ABSTRACT II

目 录 III

第一章 文献综述 1

1.1 海藻糖概述 1

1.1.1海藻糖简介 1

1.1.2海藻糖的应用 1

1.2 海藻糖的生产方法 2

1.3海藻糖合成酶 3

1.4 本论文主要内容和研究目的 4

第二章 实验材料与方法 5

2.1 实验材料 5

2.1.1菌种和质粒 5

2.1.2实验试剂 5

2.1.3实验仪器 6

2.1.4主要溶液与培养基 7

2.2实验方法 7

2.2.1海藻糖合成酶突变体的筛选与设计 7

2.2.2海藻糖合成酶的酶活力测定 9

2.2.3高效液相色谱法测定产物与底物 9

2.2.4 液相标准曲线 9

第三章 结果与分析 12

3.1 活性中心位点 12

3.2 突变位点的选定 12

3.3 突变体的获得及酶活检测 13

3.4 结果分析 14

第四章 结论与展望 15

4.1结论 15

4.2展望 15

参考文献 17

致 谢 20

第一章 文献综述

1.1 海藻糖概述

1.1.1海藻糖简介

海藻糖是一种结构稳定，无毒无害的天然多糖^[1-2]。在很多动植物和微生物体内都普遍存在，如平时生活中常常见到的的菌类、菇类、藻类等食物中都有一定含量，特别是在一些菌类中，质量分数高达15%^[3]。研究表明，部分物种对干旱、高温、低温等不利条件的抗性特征与海藻糖存在其体内有关系。因为体内含有海藻糖的缘故，许多动植物在特定条件下干燥，脱水后仍能维持其活性，并且等到再次遇水就能马上恢复原来的样子，于是可以保存其原来的口味、颜色和营养^[4-5]。在海藻糖存在的条件下，一些原本对储藏条件要求比较严格的蛋白质，干燥复水后仍然能够维持良好的保护作用^[6]。正是因为这么多有用的功能，人们的研究也就逐渐深入，其在各个方面得到普遍应用。

目前，研究者推测海藻糖的保护机制主要有三种，分别为“水替代”(Water Replacement) ^[7]、“玻璃转换”(Glassy transformation) ^[8]和“优先排阻”(Priority exclusion) ^[9]。然而具体是哪一种机制对生物大分子的保护起主导作用还没有定论。

1.1.2海藻糖的应用

海藻糖的化学性质非常稳定，相对生物大分子来说有一种保护作用，甜度远低于蔗糖^[10]。又因为海藻糖在小肠中的分解吸收比较缓慢，所造成的血糖含量变化相对平缓，因而在一些疾病预防和饮食方面具有一定的应用价值^[11]。海藻糖还可以被视为新型的天然防腐剂^[12]。在加热条件下，含有蛋白质的食品，如果其原有的品质和风味保持不变，将难以维持，而海藻糖可以破坏还原糖和游离氨基之间的反应^[13]，从而抑制美拉德反应的发生，保持食品本来的口感、颜色、组织构成和烹调属性^[14]。