摘 要

甲醇作为生物反应原料具有价格低、来源广、含能高等优势，但大多数细胞不能利用甲醇作为碳源。因此我们合成来源于甲醇芽孢杆菌的甲醇脱氢酶（Mdh）、3-己糖-6-磷酸合酶（Hps）和3-己糖-6-磷酸异构酶（Phi），来改造大肠杆菌，使其能够利用甲醇。通过¹³C 标记，我们证明该大肠杆菌菌株将甲醇转换为生物质组分。为了提高大肠杆菌对甲醇的利用率，我们还加入了分别导入了同源激活蛋白nudF和异源激活蛋白ACT。结果表明，引入nudF蛋白活性的菌株活性提高4倍，引入ACT蛋白的菌株活性提高1.4倍。我们还发现，甲醇氧化过程中产生的NADH对赖氨酸产量的提高具有促进作用。在实验中，我们测得以甲醇为碳源的大肠杆菌的NADH含量比普通的大肠杆菌含量要低，间接说明了甲醇作为原料的优越性。

关键词： 甲醇 甲醇脱氢酶 同原激活蛋白 NADH

Escherichia coli intracellular transformation of methanol to lysine

Abstact

Methanol as a raw material for biological reactions has a low price wide source high energy advantages but most cells can not use methanol as a carbon source. (Mdh) 3-hexose-6-phosphate synthase (Hps) and 3-hexose-6-phosphate isomerase (Phi) from Bacillus amyloliquefaciens were used to transform E. coli So that it can use methanol. By 13C labeling we demonstrate that the E. coli strain converts methanol to a biomass component. In order to increase the utilization of methanol to E. coli we also added the homologous activator protein nudF and the heterologous activator protein ACT respectively. The results showed that the activity of the introduced nudF protein was increased by a factor of 4 and the activity of the introduced ACT protein was increased by 1.4 times. We also found that NADH produced during the oxidation of methanol has a catalytic effect on the increase in lysine production. In the experiment we measured that the NADH content of Escherichia coli with methanol as the carbon source was lower than that of the normal E. coli and the superiority of methanol as the raw material was explained indirectly.

Key Words: Methanol; methanol dehydrogenase ; Homologous- activator protein; NADH

目录

摘要 2

Abstact 3

第一章 绪论 7

1.1 一碳化合物的概念 7

1.1.1 一氧化碳的利用现状 7

1.1.2 二氧化碳的利用现状 7

1.1.3 甲烷的利用现状 7

1.2 甲醇利用现状和优势 9

1.2.1甲醇的利用现状 9

1.3甲醇利用微生物的研究现状 10

1.3.1 甲醇代谢途径中的关键酶 10

1.3.2 甲醇代谢途径的研究 10

1.4合成甲醇利用大肠杆菌的路径和现状 11

1.5 赖氨酸的概述 12

1.5.1 赖氨酸的介绍 12

1.5.3生物合成赖氨酸中存在的问题 13

1.6本课题的意义、目的及内容 13

1.6.1 目的、意义 13

第二章 实验方法和材料 14

2.1 实验材料 14

2.1.1 实验器材 14

2.1.2 实验试剂 15

2.1.3 实验菌株 16

2.2 实验方法 16

2.2.1 大肠杆菌中质粒提取 16

2.2.2 赖氨酸合成及甲醇代谢菌株的构建 17

2.2.3 甲醇代谢途径中限速酶的提高 18

2.2.4 甲醇脱氢酶的测定 18

2.2.5 ¹³C甲醇标记实验 18

2.2.6 NADH含量的测定 19

2.2.7 甲醇含量的测定 20

2.2.8 同源臂连接赖氨酸合成相关基因至质粒上 20

第三章 结果与分析 21

3.1 甲醇代谢路径及提高限速酶 21

3.1.1 甲醇代谢路径的组装 21

3.1.2 提高限速酶甲醇脱氢酶的改造 22

3.2 甲醇脱氢酶的酶活数据 24

3.2.1 甲醛检测的标准曲线 24

3.2.2 甲醇脱氢酶酶活 24

3.2.3 NADH转化至NADPH的菌株构建 25

3.3赖氨酸合成 26

3.3.1 赖氨酸合成路径 26

3.3.2 合成赖氨酸菌株构建 27

3.4 ¹³C甲醇代谢实验 29

3.4.1 ¹³C甲醇标记实验甲醇代谢 29

3.4.2 ¹³C甲醇代谢流及代谢组学分析 29

3.5 NADH的检测 30

3.5.1 NADH检测的标准曲线 30

3.5.2 构建菌株的NADH检测 30

第四章 结论与展望 31

4.1结论 31

4.2 展望 31

参考文献 32

致谢 34

第一章 绪论

1.1 一碳化合物的概念

一碳化合物是指分子中只含有一个碳原子的化合物。CO、C0₂、甲烷、甲醇等均属于一碳化合物^[1]。一些特殊的微生物可以用这些碳化合物作为碳源生长，如蓝细菌硝化细菌等^[2]。这在日益枯竭的石油资源和当今社会恶化的环境中具有重大意义。

1.1.1 一氧化碳的利用现状

有一种一氧化碳菌，在有氧条件下，这种细菌可以将一氧化碳氧化成二氧化碳，并利用本方法获得的能量将无机碳吸收到有机碳中^[3]。研究表明，一些光能异养细菌的氢生产系统的光合异养水汽化反应以一氧化碳作为唯一的碳源在没有光的情况下生长^[4]。

1.1.2 二氧化碳的利用现状

自然界的中自养型细菌绝大多数都是以无机碳为碳源的。这些自养菌中的许多是二氧化碳作为碳源，例如使用二氧化碳作为碳源的硝化细菌^[5]。植物也是以二氧化碳为唯一碳源。二氧化碳来源非常广泛，价格低廉，不过由于它是温室气体，限制了其进一步的应用。

1.1.3 甲烷的利用现状

甲烷利用菌是一种甲基消耗细菌。目前研究最多的是使用甲基消耗细菌来生产单细胞蛋白，天然气作为原料发酵生产多糖维生素丙酮叮醉细胞色素和甲醇^[6]。天然气作为生产单细胞蛋白质研究的原料，由于提供新的蛋白质原料来源，过程简单易行，逐渐受到关注。

以天然气为原料生产的单细胞蛋白, 蛋白质含量在50%~70%之间。其中含有全部必需氨基酸，某些维生素含量也较高。在安全性方面, 因是气态碳源,且属于易燃易爆气体，具有安全隐患，教使人担心。经化学分析及动物试验, 表明是较为理想的饲料^[7]。

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