摘 要

Janthinobacterium sp. B9-8比较基因组学分析及产紫色杆菌素的合成。紫色杆菌素细菌因其产生紫色色素而激起了科学家们的好奇心。紫色杆菌素是由两个色氨酸分子，经过五种酶的作用下缩合形成的双吲哚。其生产所需的基因簇vioABCDE 和所采用的调节机制已小范围的在产紫色杆菌的菌株中展开了研究。经研究表明，紫色杆菌素具有多种的生物活性，如抗癌，抗菌，抗病毒，抗氧化等。我们运用基因组比对的方法，分析了Janthinobacterium sp. B9-8的基因组，预测了产紫色杆菌素的基因序列。它是由5个基因vioABCDE构成的，调控着整个紫色杆菌素的生物合成，长约7.3kb。为了体外异源合成紫色杆菌素，本课题将vio基因簇分解成两段，分别为vioAB和vioCDE，同时使用含双T7启动子的pRSFDuet系列，旨在大肠杆菌中进行表达。以色氨酸为底物，在大肠杆菌中，表达质粒pRSFDuet-vioAB-vioCDE产生紫色杆菌素。但并未成功。

关键词：紫色杆菌素 vioABCDE操纵子 异源表达

Comparative genomics analysis of janthinobacterium sp. B9-8 and synthesis of violacein

Abstract

The bacteria producing violacein has attracted great attention of scientists due to its distinguishing purple hues. Two tryptophan molecules form the bisindole violacein via the action of the combine of five enzymes .Vio ABCDE ，the genes required for production of violacein , and its mechanisms of regulatory have been studied in part of violacein-producing strains.As is shown in research,violacein possesses antiumoral , antibacterial , antiviral and antioxidant activities. We used the method of genome comparison to analyze the genome of Janthinobacterium sp. B9-8, and predicted the gene sequence of violacein. It is about 7.3kb is composed of five genes vioABCDE and control the whole biosynthesis of violacein.In order to heterologous synthesize violacein in vitro, the vio gene cluster is divided into two parts, vioAB and vioCDE, respectively, and the pRSFDuet series containing double T7 promoter is used to express in Escherichia coli. Expression plasmid pRSFDuet-vioAB-vioCDE, typtonphan as a substrate, produces violacein in Escherichia coli .But we failed.

KEY WORDS ：Violacein Operon of Vio ABCDE Heterologous expression

目 录

摘 要 I

Abstract II

第一章 文献综述 1

1.1背景 1

1.2紫色杆菌素的生物合成 1

1.3天然宿主菌株生产紫色杆菌素 3

1.4在大肠杆菌和其他异源宿主中产紫色杆菌素 3

1.5紫色杆菌素生物活性 6

1.5.1 抗菌性 6

1.5.2 抗原生动物活性 6

1.5.3 抗病毒性 6

1.5.4 抗肿瘤细胞 6

1.6 总结 7

第二章 实验材料与方法 8

2.1实验材料 8

2.2 实验方法 9

2.2.1 生物信息学方法 9

2.2.2 主要溶液成分与培养基 10

2.2.3 Janthinobacterium sp. B9-8基因组的提取 10

2.2.3 紫色杆菌素基因簇的扩增 11

2.2.4 目的基因的回收 12

2.2.5 目的基因及质粒的双酶切 13

2.2.6 目的基因与质粒的连接 14

2.2.7 重组质粒转化DH5α 15

2.2.8 菌落PCR验证 15

第三章 实验结果 16

3.1 紫色杆菌素基因簇生物信息学分析 16

3.2 Janthinobacterium sp. B9-8基因组的提取 19

3.3紫色杆菌素基因簇的扩增 21

3.4 目的基因及质粒的双酶切 23

3.5 重组菌PCR验证 24

附录：vioABCDE基因序列 26

第四章 结论与展望 32

参考文献 33

致谢 36

第一章 文献综述

1.1背景

作为微生物的次级代谢产物，紫色杆菌素是由两分子色氨酸氧化缩合而成的双吲哚衍生物，是一种非水溶性的蓝黑色色素，结构式如图1.1所示。目前已经发现的产紫色杆菌素的菌株，主要是：Chromobacteerium violaceum , Janthinobacterium. lividum, Alteromonas luteoviolacea , Pseuoalteromonas luteoviolacea , Duganella sp. B2等革兰氏阴性菌。^[1]本课题中，主要的菌株Janthinobacterium sp. B9-8就是一株革兰氏阴性菌。

图1.1 紫色杆菌素

1.2紫色杆菌素的生物合成

紫色杆菌素生物合成的研究起始于20世纪30年代。Tobie发现添加氧可明显缩短紫色杆菌素合成的世纪，这也说了氧对紫色杆菌素合成起着重要作用。20世纪50年代，DeMoss和Evans发现紫色杆菌素的合成需要氧和色氨酸。^[2]后来，Momen和Hoshino通过同位素标记，证实了紫色杆菌素中的C、H、O原子均来自与色氨酸分子。^[3]随后，August等人认为紫色杆菌素生物合成是由约8kb左右的基因簇控制，整个基因簇由4个相邻的ORFs组成，即vioABCD。2006年，Sanchez发现了第五个酶vioE，并揭示了这五个酶在紫色杆菌素的合成作用顺序，vioA→vioB→vioE→vioD→vioC。^[2]如图1.2所示。

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