摘 要

酵母在生产应用过程中经常遇到各种应激环境如高温高渗透压等，其中在高盐环境易下，容易导致失水过多而死亡，影响发酵后续，所以对酵母的耐盐性进行初步探讨具有一定的实际意义。本文以BY4741作为出发菌株，利用基因敲除构建出△ICT1重组株。通过盐浓度稀释点样研究其耐盐表型，对不同盐浓度下麦角固醇含量进行测定发现△ICT1重组菌经NaCl处理后只能合成少量的麦角固醇，相比于正常条件下麦角固醇含量下降了66.9%。同时，还利用PI染色法测定了细胞膜完整性，并用荧光显微镜观察染色情况，△ICT1重组菌大多数细胞被染成红色，细胞膜受损严重。最后对膜上转运蛋白基因NHA1和ENA1转录水平进行了Q-PCR测定，进一步验证了ICT1的敲除可能也会通过下调离子转运蛋白基因的转录水平，降低质膜的离子转运能力，最终导致酵母耐盐性的下降。 

关键词：酵母菌 基因敲除 耐盐性 ICT1

Effect of ICT1 gene knockout on salt tolerance of yeast

ABSTRACT

Yeast often encounters various stress environments such as high temperature and high osmotic pressure in the production and application process. Among them, in the high salt environment, it easily leads to excessive water loss and death, affecting the subsequent fermentation, so the salt tolerance of yeast The preliminary discussion has a certain practical significance. In this study, BY4741 was used as the starting strain, and the recombinant strain ICT1 was constructed by knockout. The salt-tolerance phenotype was studied by diluting samples with salt concentration. The ergosterol content was determined at different salt concentrations. It was found that the ΔICT1 recombinant strain could only synthesize a small amount of ergosterol after NaCl treatment, compared to normal conditions. Ergosterol content decreased by 66.9%. At the same time, the integrity of the cell membrane was measured by PI staining, and the staining was observed by fluorescence microscopy. Most cells of the ICT1 recombinant strain were stained red and the cell membrane was severely damaged. Finally, a Q-PCR assay was performed to determine the transcription levels of the transporter genes NHA1 and ENA1 on the membrane. This confirms that the knockdown of ICT1 may also result in down-regulation of the ion transporter gene transcription level and decrease the ion transport capacity of the plasma membrane. Decline in yeast salt tolerance.

Key words: yeast gene knockout salt tolerance ICT1

目录

摘 要 I

ABSTRACT II

第一章 文献综述 1

1.1 酿酒酵母的耐性机制 1

1.1.1 金属离子的动态平衡对酵母菌耐盐性的影响^[1] 1

1.1.2 相关基因的表达 1

1.1.3 细胞表面的脂质变化 1

1.2 基因敲除技术的研究进展 2

1.3 酵母菌耐盐性研究进展 3

第二章 实验部分 4

2.1 实验材料 4

2.1.1 菌种与质粒 4

2.1.2 主要工具酶与试剂盒表 4

2.1.3 主要试剂 5

2.1.4 主要仪器 5

2.1.5 培养基 6

2.2 实验方法 6

2.2.1 pUG6质粒的提取 6

2.2.2 ICT1基因敲除盒的引物设计 6

2.2.3 ICT1基因敲除盒的构建 7

2.2.4 阳性转化子验证 7

2.2.5 酵母电转化感受态的制备 8

2.2.6 酵母的电转化 9

2.2.7 不同NaCl浓度的稀释点滴实验 10

2.2.8 PI染色测定膜完整性 10

2.2.9 荧光定量PCR的测定 10

第三章 结果与讨论 11

3.3 结果与讨论 11

3.3.1 ICT1基因敲除盒的验证 11

3.3.2 ICT1基因敲除组件的电转化 11

3.3.3 转化子的筛选验证 12

3.3.4 不同盐浓度下BY4741和重组菌△ICT1的稀释点滴实验 13

3.3.5 BY4741和△ICT1重组菌在不同盐浓度下麦角固醇含量的测定 14

3.3.6 荧光显微镜测定膜完整性 15

3.3.7 荧光定量PCR测定酵母细胞膜上转运蛋白基因的转录水平 15

第四章 结论与展望 17

4.1 结论 17

4.2 展望 17

参考文献 18

致谢 19

第一章 文献综述

1.1 酿酒酵母的耐性机制

1.1.1 金属离子的动态平衡对酵母菌耐盐性的影响^[1]

影响酵母菌的耐盐性因素很多，其中影响最大的就是金属离子的动态平衡，这里面有Na 的外流，膜的极性状态，液泡中Na 浓度等^[2]。酵母可以通过多种方式对有毒阳离子进行运输，比如质膜上存在的两种离子转运体Nha1p和Ena1p，与质子泵共同作用，将有毒阳离子运输到胞外，这两种离子转运体受多种途径调控，如Hog途径和Ga磷酸调节途径，具有维持膜电势的功能。在细胞器膜上也存在离子转运体Nhx1p和Vhc1p等，对有毒阳离子进行区隔化作用，提高酵母的耐受性^[3]。

1.1.2 相关基因的表达

有关实验数据表明酿酒酵母在缺乏小分子抑制因子SFK1（FK5061的抑制器）时，随着活性氧的释放，线粒体随即死亡，这表明SFK1的功能与线粒体直接相关，在缺失SFK1的酵母菌株中，线粒体功能受损降低了酿酒酵母的耐受性。Luisa等发现在酵母菌耐盐性中相关基因的表达也起着非常重要的作用，比如在高胁迫的盐浓度中，GUP1,GUP2以及GUT1等基因高度表达^[4]。采用western blot的方法，我们也从蛋白水平论证了SOD1在高盐浓度应答中发挥了重要的作用^[5]。

1.1.3 细胞表面的脂质变化

在酵母菌的耐受性研究中，有研究学者表明细胞表面修饰也是一种重要的原因，首先这种猜测就在酵母的有机溶剂抗性中得以证明。表面修饰一个明显的特征就是磷脂含量的变化，有报道称恶臭假单胞菌菌株能够对膜进行自我修复以及膜磷脂的生物合成从而对有机溶剂有一定的耐受性，在磷脂成份的分析报告中显示有大量的PE存在。当恶臭假单胞菌菌株在邻二甲苯的存在下生长，PE的量很高，于是推测在磷脂增加时，对于稳定细胞膜的结构是十分必要的。

在研究酿酒酵母对异辛烷的报道中发现，有许多基因的表达水平都上调了，其中ICT1最为明显，该基因编码的蛋白属于α/β水解酶蛋白，对结构进行分析它有脂质结构域和脂肪酶水解酶/酰基转移酶域^[6]，基于这样的发现，08年有课题组对ICT1与磷脂代谢的关系进行了研究，推测出一种可溶性脂质生物合成途径，在烷烃暴露条件下，诱导了ICT1的表达以及磷脂的合成，最终促使了细胞膜的修复。其实对有机溶剂耐受性是受多种途径调控的，从这篇文章报道发现的磷脂成分变化以及膜修复可以给之后的研究者提供一个新的思路，也许膜修复对酵母的其他耐受性也能起到很重要的作用。到15年又有课题组在研究烷烃耐受性时，构建了一系列的转录因子，而这可以提高酵母的耐受性，通过RT-PCR发现ICT1作为膜修复的基因的表达水平上升了，进一步说明ICT1的重要性。所以基于以上发现可以推测ICT1基因是否也影响到酵母的其他耐受性如耐盐性。

1.2 基因敲除技术的研究进展

基因敲除是20世纪末发展一种先进的生物分子技术。这是一种以某种方式取代体内特定基因的技术。一般而言，基因敲除运用同源重组的原理，将外源的DNA序列与体内相近甚至相同的序列发生同源交换，从而达到基因敲除的目的。这种方法可以产生准确的基因突变，并且还可以正确纠正人体的基因突变^[7]。基因敲除和基因插入的技术包括Cre/LoxP系统，FLPI系统等。酿酒酵母用于生产食品和酒精饮料，现在用于各种行业，如医学药品等^[8]。酿酒酵母不表达内毒素，因此不具有致病性。它被归类为GRAS（遗传反弹被认为是安全的），并广泛用于面包，酒和啤酒的工业生产^[9]。在菌种选择中，应确保啤酒酵母的最佳酿造特性^[10]，这不仅仅能降低工业成本而且能提高产品的质量，为了实现这个目标，基因工程是最有效和理想的方法^[11]。基因敲除是在体外构建基因敲除盒，然后转入到体内，通过同源重组替换到相近或者相同的序列，并且靶向靶片段与染色体DNA具有稳定的遗传性。基因敲除技术^[12]是20世纪70年代在酿酒酵母（Saccharomyces cerevisiae）中引入的一种基因敲除技术，利用PCR技术构建出基因敲除盒是最近发展的一项比较成熟的技术，然后在敲除盒中引入抗性基因进行抗性筛选。通过电转化技术引入酵母细胞中达到同源重组的目的。

1.3 酵母菌耐盐性研究进展

近年来对酵母耐盐性的研究已取得突破性进展，细胞膜膜上Na ，K 的通道转运会有一定的影响，并且膜上可能还存在特定的蛋白能帮助这些离子通道蛋白正确定位^[13]。总之，细胞膜一定程度上对酵母抵抗外界渗透压有影响。那么，如果一些编码膜磷脂成分的基因突变或被敲除会不会对酵母抗高渗有一定的影响^[14]？有文献报道膜成分相关基因ICT1的敲除与过表达能够提高酵母对烷烃极端环境的耐受性，由此我们推测，其他极端环境下这个基因也有可能发挥作用。