摘 要

肠毒素是一种常见的病原菌，因为其难灭活，对蛋白酶有抗性，很难被破坏的特性一直是食品检验中的重点之一。鉴于目前国内大多对于肠毒素的检测技术耗时较长、操作复杂等缺点，本论文基于核酸纳米探针的生物传感器结合电化学检测方法，发展了对于肠毒素的简单、快速、准确的检测新方法。

本实验中主要研究了核酸纳米探针对于肠毒素检测的原理认证，通过不同浓度的核酸适配体的比对，选出合适的适配体浓度，最后通过以已知浓度的SEB得出实验曲线，最后结合实际样品（豆奶）进行验证，最终得出核酸纳米探针用于电化学快速检测肠毒素的方法：取豆奶加5倍体积的Tris溶液（0.25 mol/L，pH = 8.0）和不同体积的SEB（150 ng/ml）进行稀释，混匀，以5000 r/min离心10 min，将在表面形成一层脂肪，变成脱脂乳^[1]。取上清液加PBS进行稀释，混匀，然后和提前温育好的P1-P4进行定量添加并滴于电极表面，反应。最后通过电极工作站采用计时电流法得出实际样品的电化学信号，和标准样品的标准曲线进行对比从而得出实验结果。本实验操作简单、反应灵敏，可实现对于食品中肠毒素的快速检测。

关键词：核酸纳米探针 电化学 肠毒素 计时电流

Nucleic acid nanoprobe for electrochemical rapid detection of enterotoxin in soybean milk

ABSTRACT

Enterotoxin is a common pathogen, because it is difficult to inactivate, it is resistant to protease, and its hard to be destroyed has always been one of the focuses in food inspection. In view of the long time-consuming and complicated operation of the detection technology for enterotoxins in China, we use nucleic acid nano-probes combined with electrochemical detection methods (chronoamperometry) to perform simple, rapid, and accurate detection of enterotoxins.

In this experiment, we mainly studied the principle authentication of nucleic acid nanoprobes for detection of enterotoxins. We selected suitable aptamer concentrations through comparison of different concentrations of aptamers, and finally obtained experiments by using known concentrations of SEB. The curve, finally combined with the actual sample (soybean milk) was verified, and finally the nucleic acid nanoprobe was used for electrochemical rapid detection of enterotoxins: soymilk plus 5 volumes of Tris solution (0.25 mol/L, pH = 8.0) and Different volumes of SEB (150 ng/ml) were diluted, mixed, and centrifuged at 5000 r/min for 10 min to form a layer of fat on the surface and turn into skim milk. Take the supernatant and dilute with PBS and mix. P1-P4, which was incubated well in advance, was added quantitatively and dropped on the electrode surface to react. Then the chronoamperometric method is used to finally obtain the experimental curve of the actual sample, and the curve of the standard sample is compared to obtain the experimental result. The experiment is simple, sensitive, and can achieve rapid detection of enterotoxins in foods.

Keyword: Nucleic acid nanoprobe; Electrochemistry; SEB; I-T

目录

摘要 I

ABSTRACT II

目录 III

第一章 文献综述 1

前言 1

1.1核酸纳米探针的简介 1

1.1.1 发展历史 1

1.1.2 实际应用 2

1.2 检测方法 2

1.3 研究意义 3

1.4 实验思路 3

第二章 实验材料与方法 6

2.1 实验仪器和试剂 6

2.1.1 仪器与设备 6

2.1.2 试剂与材料 6

2.2 实验方法 8

2.2.1 实验前准备 8

2.2.2 原理验证 10

2.2.3 自然冷却和快速冷却 11

2.2.4 筛选合适浓度的P5 12

2.2.4 筛选合适浓度的SEB 13

2.2.5 实际样品的测定 13

2.2.6 电位扫描 14

第三章 结果与讨论 15

3.1 电化学表征 15

3.2 TTP_DNA浓度和SEB孵育时间的优化 15

3.3 SEB标准曲线测定 16

3.4 选择性验证 17

3.5 实际样品检测 18

第四章 结论与展望 19

4.1 结论 19

4.2 展望 19

参考文献 20

致谢 23

1. 文献综述

前言

一直以来的食品安全问题都是国家、社会和人民群众所最为关心的问题之一。随着现代养殖种植技术的提高，规模的不断扩大，人们日常吃的食品越来越丰富和多样化的同时，人们对于食品安全也越来越重视。对于食品的检测是作为保障食品质量与安全的方法中极为重要的一种，金黄色葡萄球菌作为最常见致病菌的一种，被认为是诱发许多食源性疾病的病原菌之一，是食品检测中必不可少的检测项目之一，而B型肠毒素是最耐热，毒性最高，能够引起很多疾病，因此一种能够简单、快速、灵敏的肠毒素检测方法对于整个食品检测行业来说都是十分重要的，能够快速、灵敏地检测低浓度SEB是目前研究的重点。根据其抗原性，肠毒素可分为A-E和G-I八种血清型，而且耐热，耐蛋白酶，因此它们不易在消化道中被破坏^[18]。肠毒素常见于豆制品、奶制品、鸡蛋、肉类等等食品当中。目前我国对于肠毒素的检测方法有很多种，比如鉴别培养基法、3M快速检测试片法、乳胶凝集试验法、ELISA、多重PCR、荧光定量PCR等等^[22]，这些检测方法已经在传统的检测方法基础上进行了改进，比如积极利用新技术进行缩短试验周期，像国标法需要48 h，而鉴别培养基快速检测法只要24 h；再比如PCR方法除了具有特异性强，可同时检测样品量多等优点外，还比以碱基配对为原理的分子杂交更敏感和简便，但PCR实验技术要求高、费用高等特点^[12]，仍然没有完全符合我们对于快速检测的期望。其他目前的检测技术也存在容易受食品中其他物质干扰等问题。因此本实验想利用核酸纳米探针和计时电流法相结合得出一种能够更加快速精准检测食品中肠毒素的方法。

1.1核酸纳米探针的简介

1.1.1 发展历史

纳米技术起源于日本，到上世纪90年代第一个纳米技术研究机构在美国成立，2000年中国成立纳米国家科研中心。全球共有几十个国家已经投入纳米领域研发，研究领域多样化，如物理、生物、材料等多个前沿方向^[23]。纳米技术是一门应用科学，其目的在于研究纳米规模时，物质和设备的设计方法、组成、特性以及应用^[5]。

纳米探针是一种可以检测纳米级（1-100nm）的新型生物传感器。作为一种在传感技术领域发展快速的新型生物传感器，具有选择性好、灵敏度高、样本量小、精度高、操作简单等特点^[20]。在生物、医学、环境监测等多种领域得到了广泛应用。而核酸纳米探针就是纳米探针在生物领域的一种重要实现。按照性质，可以将核酸探针分为基因组DNA探针、cDNA探针、RNA探针和人工合成的寡核苷酸探针，其中较为常用的是基因DNA探针^[2]。

1.1.2 实际应用

无论是从国外还是到国内，核酸纳米探针检测在近年来的应用日趋广泛，有很多研究人员从事核酸纳米探针技术的研究。大量的研究使得核酸纳米探针在诸多领域都有着很好的实践，比如重金属检测、分子影像、腺苷的检测、医学上面对于肿瘤的治疗、可卡因的检测、药物筛选、产物扩增、DNA分析、沙门氏菌的检测等等多个方面^[25]。

1.2 检测方法

金黄色葡萄球菌的某些菌株在一定条件下能够产生很多有毒物质。共分6种(A、B、C1、C2、D、E），其中以A型引起的食物中毒最多，其次是B型和C型（本实验中主要用到的是SEB）^[9]。目前对于肠毒素的检测方法有很多种，比较传统的如采用生物细胞分离培养和鉴别；因为传统的检测方法周期长、操作复杂、实验灵敏度不高，所以近年来，一些快速检测方法流行起来，比如3M快速检测试片法、乳胶凝集试验法、ELISA、多重PCR、荧光定量PCR等等^[26]。其中应用较多的是ELISA和PCR两种。其中ELISA方法的原理是将抗原或抗体吸附在固相载体表面，并保持其免疫活性，让抗原和抗体相互之间的反应在固相载体表面进行^[13]。和传统的细胞分离培养和鉴别方法相比，虽然ELISA方法已经实现了检测速度快、费用相对较低、仪器简单以及灵敏度较高等优点，但是也有一些明显的缺点，如其特异性还有待提高，其次操作过程相对繁琐等。多重PCR，中文名称为多重聚合酶反应。是在原有PCR技术的基础上加以改进：在一个PCR反应体系中，同时加入多对特异性引物，从而对多个DNA模板或者同一模板的不同区域进行扩增多个目的片段的PCR技术^[14]。这种技术具有特异性好、灵敏度高、快速等优点，但多重PCR技术对技术要求较高，并且需要一定量的仪器。

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