摘 要

丙酮酸，又称α-氧代丙酸，因分子中包含活化酮和羧基基团，所以作为一种基本化工原料广泛应用于化学、制药、食品、农业及环保等各个领域中。同时也是所有生物细胞糖代谢及体内多种物质相互转化的重要中间体，丙酮酸作为发酵过程中重要的代谢产物，其浓度的变化能在一定程度上反映菌株的生理生长状态。因此，对发酵过程中丙酮酸浓度的监测在生物发酵生产过程和科学研究是十分重要的。在多种监测丙酮酸浓度的方法中，基于丙酮酸氧化酶制备的生物传感器是一种准确检测丙酮酸的有效手段。本论文针对商业化丙酮酸氧化酶价格昂贵，电极制备手段不成熟等缺点，旨在通过异源表达获得丙酮酸氧化酶，并将其初步应用于生物传感器中。

研究主要内容：1.通过文献查阅得植物乳杆菌是能够表达丙酮酸氧化酶的一种原始菌株，通过提取植物乳杆菌的基因组并通过NCBI比对设计了丙酮酸氧化酶的引物，成功得到丙酮酸氧化酶基因的目的片段。2.将目的基因片段与pET-28a( )载体质粒相连接，导入E. coli DH5α中扩增质粒，转入 E. coli BL21中。3.对重组菌进行诱导表达，破碎细胞、离心并获得上清液，通过镍柱（Ni-NTA）亲和层析分离纯化目的蛋白，纯化后检测丙酮酸氧化酶比活力。4.利用氧化石墨烯等材料与丙酮酸氧化酶/辣根过氧化酶制备生物传感器并对电极响应底物丙酮酸的能力进行了测定。

关键词：丙酮酸氧化酶 异源表达 生物传感器 石墨烯

Heterologous expression of pyruvate oxidase and its application in biosensor

Abstract

Pyruvic acid is an important metabolite of majority metabolic processes in cells. When bacterial cells grow, the concentration of pyruvic acid can reflect the physiological growth state of the bacterial cells. When phosphate and O₂ are present, pyruvate oxidase catalyzes thepyruvate to acetyl phosphate, hydrogen peroxide, and carbon dioxide. Because of this property, pyruvate oxidase made biosensor can be widely used in clinical, biological and food analysis.

1. The genome of Lactobacillus plantarum was extracted and the priers of pyruvate oxidase gene was designed according to the NCBI. Then the target fragment of pyruvate oxidase gene was successfully obtained. 2. The obtained target gene was ligated with pET-28a( ) vector plasmid and introduced into E. coli BL21. 3. We induced the recombinant protein, disrupted the cells and obtained the supernatant. Then the recombinant protein was separated and purified by Ni² column. 4. The pyruvate oxidase enzyme based-electrode was made, and the response performance has been investigated.

Key words:Pyruvate oxidase; Heterologous expression; Biosensor; Graphene

目 录

摘要 Ⅰ

ABSTRACT Ⅱ

第一章 文献综述 1

1.1 生物传感器 1

1.1.1 生物传感器发展历史 1

1.1.2 生物传感器原理 1

1.1.3 生物传感器分类 2

1.2 酶传感器 3

1.2.1 酶传感器简介 3

1.2.2 酶传感器特点 3

1.2.3 酶传感器的应用 4

1.3丙酮酸氧化酶 5

1.3.1 丙酮酸氧化酶简介 5

1.3.2 丙酮酸氧化酶催化原理 5

1.3.3 丙酮酸氧化酶在生物传感器上的应用 6

1.4 研究课题的意义与内容 6

1.4.1 研究意义 6

1.4.2 研究内容 7

第二章 材料与方法 8

2.1 实验所需材料 8

2.1.1 实验试剂 8

2.1.2 实验仪器 10

2.2 试验方法 10

2.2.1 丙酮酸氧化酶基因的克隆及其在E. coli中表达与纯化 10

2.2.2 丙酮酸氧化酶酶活检测分析 14

2.2.3 丙酮酸氧化酶/辣根过氧化酶电极制备 15

第三章 结果与讨论 16

3.1 丙酮酸氧化酶的克隆、纯化与酶活分析 16

3.1.1 丙酮酸氧化酶PCR扩增结果 16

3.1.2 丙酮酸氧化酶表达载体pET-28a( )-Pyox的构建与筛选 17

3.1.3 重组质粒的诱导表达 19

3.1.4 丙酮酸氧化酶的酶活测定 19

3.1.5 丙酮酸氧化酶的酶学性质研究 21

3.2 丙酮酸氧化酶在电极上的应用 22

3.2.1 丙酮酸氧化酶/辣根过氧化酶电极氧化还原曲线测定 22

3.2.2 丙酮酸氧化酶/辣根过氧化酶电极时间-电流曲线测定 24

第四章 结论与展望 25

4.1 结论 25

4.2 展望 25

参考文献 26

致谢 28

第一章 文献综述

1.1 生物传感器

1.1.1 生物传感器发展历史

最早出现的生物传感器是在20世纪60年代被Updike^[1]等研发的，它是一台葡萄糖酶电极^[2]生物传感器，并且他们制备的思路源于Clark^[3]等把电极与酶结合起来检测酶底物的设想。到了80年代，生物传感器的研究已经基本成型，并且美国在80年代最开始的4年里关于生物传感器的专利就有190项^[4]。目前为止，生物传感器的发展大体经历了三个阶段^[5]，第一阶段同时也是生物传感器的诞生发生在20世纪60年代，并且这一时期的生物传感器是由电化学电极和生物膜两部分组成。该阶段的主要特征是以酶电极为主要研究方向。而在20世纪70年代的第二代生物传感器，相比于第一代传感器的优点是运用了吸附或共价结合技术，使酶与电极的连接更加牢固，这一阶段是生物传感器的飞速发展时期并且还衍生出了多种其他类型的生物传感器，如细胞器电极、微生物电极、酶热敏电阻等。第三阶段发生在20世纪80年代并且这一时期以生物电子传感器为主要研究对象，它的主要特征是直接将生物成分与电极相连接，这样设计的优点是待测物质的浓度变化可以直接被感知并可以放大检测灵敏度，还可以将待测物质与酶反应产生的信号与信号转换处理相结合。基于此特点，相比于传统分析技术，生物传感器具有操作方便简捷、选择特异性强、灵敏度高等优势，这对于需要快速检测的医学^[6]、军事、食品工业^[7]等领域具有重要意义。

1.1.2 生物传感器原理

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