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摘 要

解脂耶罗维亚酵母菌是一种具较高安全性的柠檬酸生产菌株，该菌易于改造的单细胞结构及较高的柠檬酸产率使其成为极具潜力的工业柠檬酸发酵菌株。研究发现该菌能利用各种碳源发酵生产柠檬酸，其中油脂是其发酵柠檬酸的优良原料。地沟油是一种廉价易得但具有很高社会危害性的不可食用油脂，因此本研究提出将地沟油用于解脂耶罗维亚酵母柠檬酸的生产。首先，将利用各种地摊油作为柠檬酸发酵碳源进行比较，发现地沟油具有较高的柠檬酸发酵产率，可达到15.1 g/l，可作为大规模柠檬酸发酵的碳源；然后通过条件优化，提高地沟油法发酵柠檬酸的产率，经过优化后柠檬酸产量提高至18.9 g/l，本实验的研究将为提高地沟油的合理利用，降低柠檬酸的发酵成本提供理论基础。

关键词：解脂耶罗维亚酵母菌，地沟油，柠檬酸发酵，发酵条件优化

Abstract：Citric acid is an important organic acid which is widely used in industries. Yarrowia lipolytica is yeast with high yield of citric acid, which is considered safe and more tolerant to contamination. For Y. lipolytica, oil is a preferable carbon resource for citric acid prodcing. Illegal cooking oil is a waste in catering services which is concerned in many courtiers. As a renewable low cost raw material, the main constituent of illegal cooking oil is triacylglycerols and could be used for the formation of citric acid. In this study, citric acid production by Y. lipolytica SWJ-1b from illegal cooking oil compare with other oil was investigated, and we found illegal cooking oil is suitable for citric acid producing which could yield 15.1 g/l of citric acid. Then the compositions in the medium for citric acid production by Y. lipolytica SWJ-1b with illegal cooking oil were optimized, and after the optimization, Y. lipolytica SWJ-1b could gave 18.9 g/l of citric acid.

Key words：Yarrowia lipolytica, illegal cooking oil, citric acid producing, Optimization for citric acid fermentation

目 录

1 前言： 5

2 不同来源的油脂为原料发酵产柠檬酸 7

2.1 材料与试剂 7

2.1.1 菌种 7

2.1.2 培养基和试剂 7

2.2 方法 8

2.2.1 种子液的培养 8

2.2.2 发酵产柠檬酸 8

2.2.3 发酵柠檬酸含量的测定 8

2.3 结果与讨论 9

3 地沟油发酵产柠檬酸的培养条件优化 11

3.1 材料与试剂 11

3.1.1 培养基和试剂 11

3.1.2 菌株 12

3.2 方法 12

3.3 结果与讨论 12

参考文献 16

致谢 18

1 前言：

近年来，随着对能源需求的日益增大，与”能源”相关的新兴企业越来越角逐于现代化能源市场的舞台。柠檬酸作为应用于饮料业、食品业、农业、医药业、纺织业等众多领域的能源之一，其工业化的生产开发存在着广阔的拓展空间：我国国内市场柠檬酸人均年消耗量仅约0.1 kg，是发达国家的人均年消耗量的1/20至1/15。柠檬酸的消耗量与需求量之间，我国经济发展速度不断攀升，而国内人民需求却未充分调动，这种矛盾使得柠檬酸规模化生产的市场前景十分广阔。

目前，黑曲霉菌（Aspergillus niger）是目前应用于柠檬酸生产的主要菌株。然而，该菌在柠檬酸生产过程中也存在不容忽视的缺点：第一，黑曲霉具有潜在的致病性，随着世界卫生组织对食品工业安全要求的提高，越来越多的人对利用黑曲霉生产柠檬酸的安全性提出了质疑。第二，黑曲霉发酵生产柠檬酸的过程中容易造成水污染等环境问题^[1]。第三，黑曲霉的菌丝结构复杂使其很难利于遗传改造。为了避免这些缺点，人们正在积极寻找可以替代的安全的柠檬酸生产菌株，而解脂耶罗维亚酵母菌（Yarrowia lipolytica）由于其较高的柠檬酸产率而受到研究者的关注^[2]。Y. lipolytica具有易于改造的单细胞结构，能耐受较高的碳源初始浓度和离子浓度及较低的发酵溶氧量，因此可以利用多种原料包括未经处理的廉价粗原料发酵产柠檬酸，且具有较高的发酵柠檬酸产率（表1），这使得该菌成为柠檬酸发酵菌种的良好选择。Y. lipolytica属Dipodiascacea科^[3]，具有二态性，根据生存条件的不同有单细胞和多细胞菌体之分^[4]。其菌落呈膜状奶油样，生殖方式为出芽生殖，不能在高于32 ºC的温度下存活，为好氧菌，可以从酸奶、香肠、奶酪等食品中分离得到，不具有致病性，目前被认作为最安全的酵母菌。

表1 酵母菌利用不同原料产柠檬酸

Table 1 CA production using alternate substrates with yeast.

菌株	原料	CA产 量 (g/l)	文献
Y. lipolytica A-101	甜菜糖蜜	54.0	Soccol et al., 2006[5]
Y. lipolytica N15	甘油	19.1	Svetlana et al., 2011[6]
Y. lipolytica NRRLY1095	葡萄糖	77.0	Kishore amp; Kevin, 1996[7]
Y. lipolytica AWG7	甘油	139.0	Anita et al., 2009[8]
Y. lipolytica AWG7	粗甘油	154.0	Anita amp; Waldemar, 2010[9]
Y. lipolytica VKM Y-2373	乙醇	105.4	Arzumanov et al., 2000[10]
C. oleophila ATCC 20177	葡萄糖	50.0	Anastassiadis et al., 2002[11]
Y. lipolytica ACADC50109	葡萄糖	42.9	Papanikolaou et al., 2006[12]
Y. lipolytica	蔗糖	140.0	Förster et al., 2007[13]

目前，国内外工业柠檬酸的大规模生产均以粮食中的淀粉质和糖蜜为原料，我国粮食资源丰富，生产的柠檬酸质优价廉而销往世界各地，已成为世界第一柠檬酸出口国。近年来粮食发生世界性短缺而价格飞涨，存在严重的粮食安全问题，造成柠檬酸生产原料价格大幅度上涨，柠檬酸低成本生产优势在不断减小^[14]，因此开发廉价原料是柠檬酸生产领域的主要研究方向之一。

地沟油也称泔水油或潲水油，主要来自餐饮业中的废弃油脂，是餐饮业洗漱中含油脂的废水经油水分离器或者隔油池分离后产生的不可再食用的油脂^[15]，这些油脂废水如果直接排入下水道(沟), 流进河流湖塘，每公斤废弃油脂将会造成15000平方米大面积的水质富营养化。更为严重的是，社会上的一些不法分子在饮食服务业的隔油污水池中回收肮脏、腐败不堪的废油脂并对其进行非法提炼，直接或者混合部分食用油甚至矿物油后，流入到食用油销售市场以牟取暴利^[16]。这些油如果回流到食用油市场中，将给人们的健康带来极大的危害，尤其是掺有矿物油的废弃油脂，严重的会发生食物中毒事件。如：1999年8月发生肇庆市端州区昆庆毛绒厂食堂的一起681人食物中毒事件，就是进食含有非食用油矿物油的豆油烹调菜肴所致。废弃油脂造成的危害，已经引起了社会的高度关注：上海、重庆、南京、广州等地相应的制定了有关法规，加强了对食品生产经营单位废弃食用油脂的管理。国家卫生部、国家工商总局、国家环保总局、建设部，于2002年4月15日联合颁布了：关于印发lt; 食品生产经营单位废弃食用油脂管理的规定gt; 的通知，进一步加强废弃油脂的管理。

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