论文总字数：5555字

摘 要

：草莓是颜值与营养并存的水果，市场前景广阔，草莓产业也是发展高效农业的首选项目，在沿海经济发达区，是我国优质草莓的主要生产地，但随着种植面积扩大，草莓病害也逐渐加重，直接影响草莓的产量与品质。本研究以淮安柴米河农业有限公司栽培的春季草莓为研究对象，通过形态学及分子生物学方法鉴定根腐病病原菌，结果发现引起根腐病的病原菌为腐霉菌及恶臭假单胞菌。

关键词 草莓 病原菌 鉴定

Abstract: Strawberry is a fruit with both skin value and nutrition. The market prospect is broad. The strawberry industry is also the first choice for the development of high-efficiency agriculture. It is the main producer of high-quality strawberries in coastal economically developed areas. However, with the expansion of planting area, strawberry diseases are gradually becoming more and more. Aggravation directly affects the yield and quality of strawberries. In this study, the spring strawberry cultivated by Huai"an Chaimihe Agricultural Co., Ltd. was used as the research object. The root rot pathogen was identified by morphological and molecular biological methods. The pathogen causing root rot was found to be Pythium and Pseudomonas putida.

Keywords: Strawberry pathogen identification

1 前言

草莓也被叫做“水果皇后”，果实鲜美可口，内含丰富的维生素和蛋白质，并且草莓的生长周期短，收益明显，受到广大消费者和种植者的喜爱^[1]。草莓虽原产于南美，但是在中国各地和欧洲等地广为栽培，从2003年起步，中国的草莓种植面积、草莓产量已超过美国，成为世界第一草莓国，在中国沿海地区，草莓的栽种占大部分比重，江苏的草莓栽培面积更是居全国第四位^[2]。近两年随着设施农业和高效农业的大力推广，草莓已成为农业生产者的首选种植植物，在江苏地带的草莓种植主要以钢架塑料大棚和简易日光温室促成栽培为主，少量使用塑料中棚或小拱棚进行半促成栽培，还有部分露地栽培^[3]。配栽方式一般是地栽为主，但是在种植草莓过程中，也会发生各种各样的病害，如炭疽病、根腐病、灰霉病、白粉病等^[4]，对草莓产量和品质造成很大的威胁。

在本地区种植的草莓常发生茎基腐病，该病症在本地区发病较重，为本地区流行病，本实验为鉴定茎基腐病的病原，为防止该病提供基础。

2 材料及分离方法

2.1材料

草莓病株采自淮安柴米河农业发展有限公司种植基地，采集后无菌塑封迅速带回实验室，通过切片法进行病原菌的分离。

2.2分离方法

将草莓病株用水冲去表面的土壤和砂砾，将根茎发病部位经过初步处理后，将发病组织切成相同的小块后，浸泡在酒精中消毒1min后用无菌水清洗3次，用NaCIO溶液浸泡根茎1min后用无菌水清洗3次^[5]。将处理好的组织小块接种在PDB培养基上，在恒温培养箱中培养一定时间，等到PDB培养基上长出菌落后，用接种环挑取不同形态的菌落边缘的菌丝移至新的无菌培养基上继续进行纯化培养，直至每个培养皿中只含有单一菌落，将分化好的菌落放入冰箱保存^[6]。

2.3菌种形态学鉴定

2.3.1细菌形态学鉴定

本实验采用革兰氏染色法对细菌染色后用显微镜观察细菌形态^[7]。

2.3.2真菌形态学鉴定

在无菌操作台内，用无菌吸管吸取融化的培育真菌的固体培养基，在载玻片上滴加一滴溶液，溶液冷却后在表面接种保存的真菌菌种后，在上面盖上盖玻片。将载破片放在培养皿中，培养皿底部放入一定量的水，用玻璃棒撑起，将做好的培养基放在上面，在合适的温度下培养，将培养好的载玻片取出，取下盖玻片，将盖玻片转至另一片载玻片上，等待玻片自然干燥后，用胶带固定两边玻片，用染色液染色，用显微镜观察形态^[8]。

2.4分子学鉴定

2.4.1细菌分子学鉴定

目的基因模板的提取：16SrDNA检测在PCR扩增前需要把细菌进行裂解，细菌一般采用煮沸的方式就可裂解细菌 ^[9]。

16SrDNA的PCR扩增：上游引物:5"-AGAG TT TGA TCTGGCTCAG-3"，　下游引物: 5"-TACGGCTACCT TG TTACGACT T- 3"^[10]，扩增条件如表所示

温度	时间	程序
94℃	3min	预变性
94℃	45s	30cycle
58℃	45s
72℃	1min
72℃	10min	修复延伸
4℃	∞	终止反应

成分	体积(μ l)
无菌蒸馏水	8.9
10×buffer	2
10mmol/dNTP	0.4
27F和1492R引物	4
DNA模板	0.5
Taq polymerase	0.2

将扩增好的片段选取5 μ l产物进行电泳（1%琼脂糖凝胶电泳，150V、100mA 20min）观察，并将目标条带纯化测序，测序结果在数据库上进行比对，确认细菌种类。

2.4.2真菌分子学鉴定

增菌培育：使用沙市液体培养基^[11]培育真菌，收获菌丝体后提取核酸。

提取真菌：DNA基因：取真菌培养液离心后加适量dH₂O充分研磨破碎，利用TaKaRa^[12]的真菌核酸提取试剂盒进行DNA提取。

测定核酸纯度与浓度 ：选取定量的DNA提取液进行倍数稀释，在260、280与320nm下分别测定OD值，根据结果将核酸浓度稀释到PCR模板适用浓度100~300ng/μ l^[13]。

rDNA-ITS扩增：选取ITS1（TCCGTAGGTGAACCTGCGG）与ITS4（TCCTCCGCTTATTGATATGC）为模板，以下表的PCR反应组成与反应条件进行PCR扩增^[14]。

温度	时间
94℃	2min
94℃	30s 30s 35cycles 90s
59℃
72℃
72℃	7min

成分	体积（ul）
PCR buffer(10X,Mg free)	5
MgCl2(25mM)	4
dNTP(2.5mM each)	4
Primer-F(20uM) using ITS1	0.5
Primer-R(20uM) using ITS4	0.5
Taq DNA polymerase(5U/u l)	0.25
DNA(100~300 ng/ul)	2
DH2O	Up to 50

rDNA-ITS测序与分析：将扩增好的目的核酸片段交给上海生工生物科技有限公司进行测序，将测序结果与数据库序列对比可得真菌。

2.5回接实验

2.5.1细菌回接实验

在培养基斜面上活化存放好的菌落，在常温下培养一定时间后，在斜面上倒入无菌水把菌落洗下，装入无菌三角瓶中，把每株菌种制备50ml^[15]。

将草莓苗用无菌水冲洗后，栽入灭菌过的花盆后，分别接种不同的细菌菌种，并做空白对照，将接种好的草莓苗分组后放入温室培养。

2.5.2真菌回接实验

用PDA培养基培育存放的真菌，等到真菌长出菌落后，在菌种边缘取数枚菌饼，将菌饼平均分配装入500ml的三角瓶（内含灭菌的200mlPDA培养液）中，放置在摇床上培养数天，检查生长状态以及是否被污染，确定没有污染后，将培养好的菌丝球分离出来用灭菌过的研钵将菌丝球捣碎后，用新鲜的培养液定容到原培养液体积，放置在4℃备用^[16]。

将草莓苗进行蘸根处理,是培养液完全浸没草莓苗的根部，将草莓苗栽种在灭菌好的花盆中，并设置没有浸没培养液的空白对照，观察草莓苗是否有茎基腐病的产生。

3结果分析

通过纯化分离，获得三种细菌与一种真菌，由分子学鉴定与形态学鉴定确定菌种种类

图1： 细菌革兰氏染色结果观察

图2：真菌菌落形态及菌丝形态观察

表1：菌种鉴定结果

菌种	鉴定结果	登录号
1	不动杆菌Acinetobacter sp	LC373523.1
2	芽孢杆菌Bacillus	KY425602.1
3	恶臭假单胞菌Pseudomona sputita	LT799039.1
4	/

一号细菌为不动杆菌，为革兰氏阴性菌，呈球杆状，常见成对排列，可以单个存在，有夹馍，无芽孢，无鞭毛。

二号细菌为芽孢杆菌，为革兰氏阳性菌，有芽孢。

三号细菌为恶臭假单孢菌，为革兰氏阴性菌，为短杆菌，无芽孢。

真菌形态呈丝状，含有孢子囊。

由于无法提取出真菌的DNA，故真菌无法从分子学中确认为何种真菌，从形态学上观察真菌可以确定为腐霉属。

由于淮安柴米河农业发展有限公司提供的幼苗数量有限，本研究未按照分组方式进行接种，所采用的的接种方式如下：3种细菌和1种真菌分别单独接种，3种细菌分别和真菌混合接种。在进行回接实验后，只有当恶臭假单胞菌与腐霉菌共同接种在草莓幼苗上时，草莓幼苗会引起茎基腐病，因此可以初步确定茎基腐病的病原为恶臭假单菌菌与腐霉菌共同引起。

结论

通过本次实验可以初步鉴定出引起草莓茎基腐病的病原为腐霉菌及恶臭假单胞菌，但腐霉菌还需要进一步的分子生物学验证，才能根据这两种病菌的特性与生活习性开发新型的药物，根治这种类型的草莓病变危害，为草莓行业经济的发展提供保障。

参考文献

[1]钱亚明,赵密珍,吴伟民等. 江苏草莓种植地块现状调查分析[J]. 江苏农业科学,2010(06):248-249.

[2] 解振强. 不同温度条件下草莓生长结果的差异[J]. 浙江农业科学,2011(06):1236-1238.

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