论文总字数：10335字

摘 要

乌苏里拟鲿是一种市场前景良好的名优水产品。然而，烂身病在其养殖过程中频发，已严重阻碍了乌苏里拟鲿养殖业的发展。本研究通过Illumina HiSeq2500高通量测序平台进行了乌苏里拟鲿患烂身病个体和正常个体脾脏的比较转录组测序与分析。转录组测序共获得9390648条清洁序列，并进一步组装成73772条唯一基因序列（unigene）。通过在7个公共数据库的同源比对，共有44996条unigene（61.0%）在至少一个数据库中具有同源物得到功能注释，其中3460条在所有数据库中匹配。在GO分类中有15242条unigene分为生物过程、细胞成分和分子功能。生物过程有9238条，细胞组分有2361条，分子功能有3643条。KOG总基因数注释成功了7846个。 KEGG富集分析揭示了12902条unigene被分为183个途径。患烂身病和对照组脾脏共检测到445个差异表达基因，其中262个上调基因，183个下调基因，对差异最显著的20个基因进行了通路分析。测序结果将为乌苏里拟鲿烂身病的防治和今后该鱼抗逆新品种的选育提供科学依据和理论支持。

关键词：乌苏里拟鲿，烂身病，脾脏，转录组

Abstract: Pseudobagrus ussuriensis is a famous aquatic product with good market prospects. However, the frequent occurrence of rotten body disease has seriously hindered the development of the fish culture industry in P. ussuriensis. The comparative transcriptome sequencing and analysis of the spleens of individuals with pomfret disease and normal individuals in P. ussuriensis were carried out using Illumina HiSeq2500 high-throughput sequencing platform. A total of 9,390,648 clean sequences were obtained by transcriptome sequencing, and 73,772 unique gene sequences were further assembled. Through homology comparison among seven public databases, 44,996 unigenes (61.0%) have homologies in at least one database to obtain functional annotations, of which 3,460 are matched in all databases. There are 15,242 unigenes in GO classification, which are divided into biological processes, cellular components and molecular functions. There are 9,238 biological processes, 2,361 cell components and 3,643 molecular functions. The total number of KOG genes was successfully annotated by 7,846. KEGG enrichment analysis revealed that 12,902 unigenes were divided into 183 pathways. A total of 445 differentially expressed genes including 262 up-regulated and 183 down-regulated ones were found. Moreover, 20 significant differentially expressed genes were selected for signaling pathway analyses. The results of sequencing will provide scientific basis and theoretical support for the prevention and control of pomfret disease in P. ussuriensis and the breeding of new stress-resistant varieties in future.

Keywords: Pseudobagrus ussuriensis, rotten body disease, spleen, transcriptome

目 录

1 前言 4

2 材料与方法 4

2.1 乌苏里拟鲿样本 4

2.2 所用仪器设备和试剂 4

2.3 样品RNA提取 4

2.4 文库构建及高通量测序 5

3 结果与分析 5

3.1 转录组测序、组装和基因注释 5

3.2 样品间基因表达量相关性分析 6

3.3 差异基因筛选结果 7

3.4 差异表达基因GO富集分析 7

3.5 差异基因KEGG富集分析 8

3.6 SNP和InDel分析 9

4 讨论 11

结 论 13

参 考 文 献 14

致 谢 15

1 前言

乌苏里拟鲿（Pseudobagrus ussuriensis），又名乌苏里鮠，别名牛尾巴、黄昂子、回鳇鱼 ，鲇形目，鲿科，拟鲿属的一个物种^[1]。一般栖息于静水中，是一种底层性鱼类，白天栖息于水底层而夜间则游到水上层觅食，广泛分布于黑龙江、嫩江、松花江、乌苏里江、珠江等水域，洪泽湖、太湖也有分布。6月和7月是其主要繁殖季节，适宜的繁殖水温为20到25度之间^[2]。其肉细嫩而鲜美，无肌间刺，价格高，是鱼中珍品，对环境的适应能力较强，具有较大的经济价值，是近年来人工养殖的热门新品种。目前关于乌苏里拟鲿的研究有较多报道，其中多数研究集中于人工繁殖^[3]、养殖^[4]等方面。

“烂身病”又称鱼类溃疡病，属高接触传染性疾病，可以通过鱼、鸟、网具等传播，对养殖鱼类危害较大，目前已报道的引起溃疡症的病原种类较多，细菌真菌等多种病原微生物均可引起溃疡症的发生，在生存环境温度达到15℃以上后，发病会有所增加，同时外伤也是本病发生的重要诱因^[5]。不同发病时期所表现出来的症状也有所不同^[6]。患病的较早时期，病鱼的表皮会有所脱落，表面颜色比一般鱼较黑，病鱼发展到后期，体表溃烂到会露出骨骼和内脏，严重威胁养殖鱼类健康。

在乌苏里拟鲿养殖中，烂身病已成为威胁养殖健康的重要病害，而当前相关研究则极其有限。因此，为分析患烂身病后乌苏里拟鲿脾脏的基因表达变化，本研究对患病和健康乌苏里拟鲿脾脏组织进行了比较转录组分析，以期为该病的发病机理及免疫应答反应研究提供基础依据。

2 材料与方法

2.1 乌苏里拟鲿样本

实验用乌苏里拟鲿于2018年11月取自江苏省特色水产繁育工程实验室，其中健康个体3尾，体重大小均匀。患烂身病个体为实验室养殖过程中自然发病个体，选取3尾体重接近个体。

2.2 所用仪器设备和试剂

白色解剖盘、解剖剪、尖头镊子、解剖针、乳胶手套、棉球、酒精灯、离心管、无水乙醇、液氮罐等。

2.3 样品RNA提取

本研究所用6尾乌苏里拟鲿样本分别取两组鱼脾脏组织，一组为健康组乌苏里拟鲿，另一组为患烂身病乌苏里拟鲿。每组取3尾鱼，每尾个体取脾脏组织置于1.5mL离心管中，液氮速冻备用。RNA提取时，将上述2组样本各取约10 mg于一个2 mL离心管中，加入约500 μL液氮后用Pro200组织匀浆器进行彻底匀浆。等液氮蒸发干后，按照TRIzol法提取RNA的使用说明进行总RNA提取。提取后的RNA需利用DNA酶在37℃水浴中温浴45分钟，以去除其中残留的DNA。之后利用Nanodrop 2000微量紫外分光光度计、Aglient 2100 和 Qubit 2.0生物分析仪进行质量分析。

2.4 文库构建及高通量测序

首先利用连接了磁珠的多聚胸腺嘧啶寡核苷酸链从总RNA中分离含有多聚腺嘌呤核苷酸的mRNA，之后利用片段化缓冲液将mRNA切割为随机长度的片段。利用获得的mRNA片段作为模板，进行cDNA的合成，并用AMPure XP磁珠进行纯化。纯化后的cDNA片段需经过末端修饰并加上单个腺嘌呤核苷酸后连接上接头。然后利用AMPure XP磁珠从连接接头后的cDNA中筛选合适长度的片段作为模板进行PCR扩增，从而获得转录组cDNA文库，文库构建完成之后^[7]，再利用ABI Step One Plus荧光定量PCR系统和Agilent 2100生物分析仪进行定量和定性检测^[8]。文库利用北京诺禾致源科技股份有限公司Illumina HiSeq 2500高通量测序平台进行高通量测序。

3 结果与分析

3.1 转录组测序、组装和基因注释

对2个乌苏里拟鲿脾脏样本( Sk_S、C2_S ) 进行Illumina HiSeq测序，总共产生了93960648个原始序列和90254636个(原始序列的96.06 % )清洁序列，并评估了清洁序列的质量。通过采用Trinity (Grabherr et al, 2011)对清洁序列进行拼接。使高质量的清洁序列被拼接到平均长度为1778 bp的196883个转录本中，并且产生了大小范围为265 bp至2103875 bp、长度为1912 bp的73772条unigene（表1）。为获得全面的基因功能信息，进行了七大数据库的基因功能注释基于七个公共数据库对整个unigene的功能进行了注释。其中44996条unigene在至少一个数据库中具有同源物，3460条在所有七个数据库中注释。KOG是一个对同源基因产品进行分类的数据库。根据KOG注释的结果来看，73772个总基因数注释成功了7846个（表1）。

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