摘 要

人体内源性醛类主要来源与糖和脂质体的系列氧化过程与伯胺的酶促代谢。这些生物源醛类如不及时被细胞中的解毒酶代谢，会因其对蛋白质，DNA和磷脂的过度修饰，而造成生物毒性。近年来，生物源醛类与各种疾病的关联研究以及相关的细胞毒性和细胞信号传导机制研究已成为当前研究的热点之一，而如何对生物源醛类进行准确的定性、定量分析是揭示生物源醛类毒性及其致病机理的重要基础。

在生物源醛类的分析方法中，最具代表性的是高效液相色谱-荧光检测法（HPLC-FLD），该方法具有选择性好，灵敏度高和基质效应低的优势。但由于大多数脂肪醛没有荧光基团，因此需对其进行柱前荧光衍生。本实验采用一种新型荧光衍生试剂4-丁基羟氨-7-羟基-香豆素（HAHC）来标记醛类，通过HPLC-FLD分析其衍生产物以达到生物源醛类的高灵敏、高选择性分析。

本论文具体工作如下：

I）我们利用4-丁基羟氨-7-羟基-香豆素（HAHC）成功标记了脂肪醛,通过HPLC-FLD分析实现了9种脂肪醛标样（乙醛、丙醛、丁醛、戊醛、己醛、庚醛、辛醛、壬醛和癸醛）的高选择性、高灵敏度检测。

II）在此基础上，我们对从武汉中医院以及中国人民解放军武汉总医院收集到的40例人血清样品（糖尿病患者血清样9例，高血压患者血清样17例，正常人血清样14例）进行了醛类检测分析，

III）在对样品进行定性定量实验的基础上，使用相关的统计学方法，对样品数据进行统计分析。以此来研究生物醛水平与心血管疾病之间的相关性。

结果表明，所有人血清样品中均发现了乙醛、丙醛、丁醛、戊醛、壬醛和癸醛，均未检测出己醛、庚醛、辛醛。正常人血清中的乙醛、丙醛浓度明显低于高血压患者与糖尿病患者。丁醛、戊醛、壬醛和癸醛浓度在正常人与病人中区别不大。此外，正常人血清中的乙醛、丙醛在检测到的脂肪醛中摩尔百分含量低于高血压患者与糖尿病患者。而正常人血清的丁醛、戊醛、壬醛和癸醛的摩尔百分含量均高于高血压患者与糖尿病患者。可见，生物源醛类与心血管类疾病有着密切的关联，本工作将为寻找心血管疾病标志物，探索生物源醛类的治病机理打下坚实的基础。

关键词：生物源醛类;心血管疾病; 4-丁基羟氨-7-羟基-香豆素（HAHC）;高效液相色谱-荧光检测法（HPLC-FLD）;人血清.

Abstract

The main sources of human endogenous aldehydes are the series of oxidation processes of sugars and liposomes and the enzymatic metabolism of primary amines. These biogenic aldehydes become toxic if they are not metabolized by detoxifying enzymes in the cells, due to the covalent modifications of excessive proteins, DNA, and phospholipids.In recent years, due to the discovery of various associations between biogenic aldehydes and various body health diseases, lots of biochemical studies of cytotoxicity and cell signaling effects have received widespread attention. And how to accurately and quantitatively analyze biogenic aldehydes is an important basis for revealing the toxicity and pathogenic mechanism of biogenic aldehydes.

Many methods were developed for the analysis of biogenic aldehydes in biological samples, among which High-performance liquid chromatography-fluorescence detection (HPLC-FLD) is characterized by high efficiency, high sensitivity and low matrix effects. However, most aliphatic aldehydes have no fluorescent groups, we need to perform precolumn fluorescence derivatization on biogenic aldehydes. In this experiment, 4- ((hydroxyamino)butyl) -7-hydroxycoumarin (HAHC) was used as a fluorescence derivatization reagent. Then we analyzed the derivative products by HPLC-FLD to achieve highly sensitive, highly selective analysis of biogenic aldehydes.

In this thesis,

I）A novel derivatization method was applied to analyze biogenic aldehydes with high sensitivity and selectivity. This method was established using HAHC as fluorescent labeling reagent and HPLC-FLD as detection. And nine aliphatic aldehydes( ethanal, propanal, butanal, pentanal, hexanal, heptanal, octanal, nonanal and furfural) in serum was detected and analyzed by this new method.

II）We collected serum samples from Wuhan Chinese Medicine Hospital and People's Liberation Army General Hospital of Wuhan for a total of 40 cases to detect and analyze. Among them, 9 cases were diabetic patients, 17 cases were hypertensive patients, and 14 cases were normal person.

III) We used relevant statistical methods for qualitative and quantitative analysis of samples.The correlationships between biogenic aldehyde levels and cardiovascular diseases were also investigated.

The results showed that ethanal, propanal, butanal, pentanal, nonanal, and furfural were found in all human serum samples, but hexanal, heptanal and octanal were not detected. The concentration of ethanol and propanal in normal human serum was significantly lower than that in patients with hypertension and diabetes. The concentrations of butanal, pentanal, nonanal, and furfural were not significantly different between normal subjects and patients. In addition, the molar percentage of ethanol and propanal in the normal human serum detected in the fatty aldehyde was lower than that in the hypertensive and diabetic patients. The normal human serum butanal, pentanal, nonanal, and furfural in the molar percentage were higher than those in patients with hypertension and diabetes. Obviously, biologically derived aldehydes are closely related to cardiovascular diseases. This work will lay a solid foundation for finding cardiovascular disease markers and exploring the therapeutic mechanism of biogenic aldehydes.

Keywords: biogenic aldehydes; Cardiovascular diseases; 4- ((hydroxyamino)butyl) -7-hydroxycoumarin (HAHC); High-performance liquid chromatography-fluorescence detection (HPLC-FLD); serum.

目录

摘 要 I

Abstract II

第一章 绪论 1

1.1生物源醛类概述 1

1.1.1生物源醛类的来源 1

1.1.2生物源醛类的危害性 2

1.1.3生物源醛类与心血管疾病 2

1.2生物源醛类的检测 4

1.2.1醛类化合物的检测流程 4

1.2.2醛类衍生化方法 12

1.4本论文研究的目的和意义 14

第二章 基于香豆素羟氨试剂的脂肪醛硝酮化衍生反应 15

2.1引言 15

2.2实验部分 15

2.2.1实验材料和仪器设备 15

2.2.2实验试剂 16

2.2.3实验步骤 17

2.2.4分析方法学验证 17

2.3结果与讨论 18

2.3.1 C2-C10脂肪醛混合标准溶液衍生后色谱图 18

2.3.2 分析方法学验证 18

2.4 小结 20

第三章 人血清中脂肪醛分析检测 21

3.1引言 21

3.2实验部分 21

3.2.1实验试剂 21

3.2.2实验材料和仪器设备 21

3.2.3 实验步骤 22

3.3结果与讨论 23

3.3.1人血清色谱图分析 23

3.3.2 人血清样品醛类含量与心血管疾病的相关性分析 25

3.4 小结 31

第四章 结论与展望 32

参考文献 33

致 谢 36

第一章 绪论

1.1生物源醛类概述

生物系统中产生的醛类称为生物源醛类，它们一般是由于脂质体、糖类与伯胺的一系列氧化过程而产生的，是一种重要的氧化终产物。生物源醛类具有较高的反应活性，它们易溶于水，亲电性强，能与蛋白质，脂质和DNA生成加合物，具有较强的生物毒性。目前，生物源醛类与细胞的反应活性和整体信号传导效应是当前研究的热点。尽管这些醛类的确切来源，反应活性和病理机制仍然模糊不清，但是大量研究表明生物源醛类是造成心血管疾病的主要因素之一。

1.1.1生物源醛类的来源

在大多数生物系统中，生物醛的主要来源是糖和脂质的氧化。当葡萄糖发生自氧化时，席夫碱的形成和随后的阿马多利产物重排生成乙二醛，甲基乙二醛和3-脱氧葡萄糖醛酸^[1-3]。氧化多不饱和脂肪酸（PUFA）的重排和断裂还产生这些醛类，除了α，β-不饱和醛，如4-羟基壬烯醛（HNE）和4-羟基己烯醛（HHE），丙二醛和酮醛。由于细胞膜内的许多磷脂含有PUFAs，它最初是脂质过氧化的来源，通常由超氧自由基引发。由于它们接近血液，心血管系统内的细胞和组织持续暴露于体内一些最高的O₂浓度环境里。因此，由于O₂的生成速率和随后的活性氧（ROS）形成速率与O₂浓度成正比^[4]，心血管组织对自发脂质和葡萄糖氧化的水平非常敏感。

脂质和糖类的酶促氧化是生物醛形成的另一途径。甲基乙二醛（MGO）可通过甲基乙二醛合酶，髓过氧化物酶和细胞色素P450超级家族的成员而形成。前列腺素途径中有许多氧化酶可催化PUFAs的氧化。这些加氧酶依赖性反应的产物通常比通过ROS形成的脂质过氧化物更稳定，但仍能够重排和分解，这些性质使它们成为生物醛的来源。

心血管系统内另一种生物醛的内源性来源于伯胺的酶促代谢。去甲肾上腺素（NE）和多巴胺（DA）通过单胺氧化酶（MAO）氧化脱氨生成儿茶酚醛3,4-二羟基苯基乙醇醛（DOPEGAL）和3,4-二羟基苯乙醛（DOPAL）和H₂O₂^[5]。已证明DOPEGAL和DOPAL比母体儿茶酚胺或任何下游代谢物具有更强的细胞毒性和反应性。令人惊讶的高反应性和毒性似乎源于儿茶酚和醛基的反应性。尽管儿茶酚醛与心血管疾病之间的直接联系仍有待阐明，但在临床和实验模型中的工作已经记录了MAO在缺血，糖尿病和高血压心脏损伤中的病理学作用^[6-8]。

1.1.2生物源醛类的危害性

高度氧化组织中的细胞由于它们存在的环境，必须不断处理亲电子生物醛的负担。 生物醛被定义为通过葡萄糖，不饱和脂质，伯胺和其它较少丰富的底物的自发和酶依赖性氧化而内源性形成的醛类。

并且在人体代谢过程中，由于脂质过氧化作用，也会产生一些活性羰基类化合物，其中包括α，β不饱和醛、二醛等。大量研究表明，在许多不同的生物基质中（包括血液，尿液,和呼出气）已经检测出多种醛类化合物，并且这些醛类化合物与很多心血管疾病密切相关。这些生物醛如果不被细胞中的解毒酶代谢，会因为过度的蛋白质（通常在Cys，Lys和His残基上），DNA和磷脂的共价修饰，变成毒性的。例如，Ulanowska等人在对137例确诊的肺癌患者的呼出气体样本进行分析检测时发现，与健康的非吸烟者相比，能在肺癌患者的呼出气体中检测到了戊醛、己醛和壬烷^[9]。这个结果从一定程度上说明了醛类物质在一定程度上可以帮助我们判别肺癌患者。例如，丙二醛（malonialdehyde,MDA）是脂质氧化终产物的一种，可间接反映脂质氧化的程度和氧自由基的生成水平^[10]。由对急性一氧化碳中毒迟发性脑病（delayed encephalopathy after acute carbon monoxide poisioning,DEACMP）的阐述，可知DEACMP患者入院时MDA浓度高于正常，其原因可能为脑组织缺氧，诱发脂质过氧化反应增强，MDA作为过氧化反应的产物，故MDA的浓度水平升高^[27]。又比如甲醛对呼吸、免疫、神经和心血管系统都有较强毒性^[29]。因为目前还没有能够逆转这种修饰反应的酶被发现并鉴定出来, 那么可以认为，这些反应是不可逆的。

由于生物醛类与细胞毒性和细胞信号传导效应的一些关联，学者们越来越笃定生物源醛类与人体健康是有关联的，因此越来越多的学者开始关注生物醛与各种身体健康疾病的各种关联。

1.1.3生物源醛类与心血管疾病

心血管疾病是心脏血管疾病的统称，泛指由于高脂血症、血液黏稠、动脉粥样硬化、高血压等所造成的的心脏及全身组织发生的缺血性或出血性疾病^[12]。心血管疾病是一种最严重威胁人类健康的一种疾病之一，是威胁中老年人身体健康的常见病。心血管疾病的特点是具有病种多、病因复杂、发病率高、与人类生存关系大、患病率高、致残率高和死亡率高等特点，全世界每年由于心血管疾病而死的人高达千万人。现阶段的医疗手段仍是对心血管疾病束手无策，使用上当今最完善的治疗手段，依然仍有百分之五十的概率使患者在治疗完成后生活不能自理。据2014年8月公布的《中国心血管病报告2013》显示，我国心血管疾病患者己达2.9亿，每年约350万人死于心血管疾病。虽然心血管疾病可防可治，但从全民整体死亡发生情况来看，心血管疾病导致的死亡仍排在城乡居民总死亡原因的首位，并且逐年上升^[13]。

随着科技水平的提升，人们生活水平的提高，饮食，生活习惯也有了很大的改善，这也导致了人们摄入脂质的量也越来越庞大。而当脂代谢异常时，各类心血管疾病随之产生。这两者相互促进，导致了脂代谢异常的发生率呈不断升高的趋势。

高级脂氧化终产物（ALEs）便是脂质代谢产生的其中一种结果。ALEs是指由脂质过氧化作用和类脂物代谢作用产生的活性羰基物质与大分子亲核残基进行非酶促反应所形成的各种共价化合物^[14]。ALEs的前体通常是亲脂性的，因此它们与细胞膜的组分相互作用，导致膜完整性破坏，看起来像是水泡形成^[15]。 水泡是质膜囊泡，当膜结构域（脂质筏）与细胞骨架分离时，通常在细胞凋亡和形成中观察到^[16]。然而，泡状细胞在炎症过程中的系统信号传导中起作用，因为它们以膜囊泡的形式从细胞释放^[17]，因此有助于有机体慢性炎症过程的发生和发展。因此其与某些疾病，如糖尿病、心血管疾病等疾病的发生、发展密切相关。

并且脂肪醛通过酶依赖和脂质，葡萄糖和伯胺的自发氧化，在生物系统中不断形成。 这些高反应性的生物亲电试剂可能通过蛋白质，脂质和DNA的共价修饰而变成毒性的。细胞维持一系列解毒酶，作为一种保护机制，负责代谢和去除生物醛。 这些酶包括醛脱氢酶，醛糖还原酶，羰基还原酶，醛还原酶和谷胱甘肽依赖家族中的酶^[17]。 然而，在急性（例如，局部缺血，败血症）和慢性心脏代谢应激（例如高血压，糖尿病）期间，这种酶网络可能不堪重负。

以上是毕业论文大纲或资料介绍，该课题完整毕业论文、开题报告、任务书、程序设计、图纸设计等资料请添加微信获取，微信号：bysjorg。

相关图片展示：