摘 要

目的：本研究目的是针对肝脏肿瘤的HER2蛋白的DNA适配体的结构优化，通过对适配体核苷酸组成的替换和缩短，提高适配体与靶向分子的结合性能。为后期的临床研究做好基本理论工作。

方法：对DNA/RNA,以及抗体等的生物学结构进行剖析了解，在已经确定的核酸适配体的基础上，对靶点进行进一步的了解，进而对HER2的现有适配体进行二级结构的优化设计，通过NCBI,以及Cylofold等软件对适配体的结构进行预测和分析，确定本次设计的新适配体在保持特异性结合能力的同时还具有更稳定的生物学结构。

结果：经过上述缩短替换我们把原HA5[6]适配体86个碱基缩短到了70个，因此我们可以通过把优化设计后的碱基序列，在二级结构预测软件Cylofold中对新适配体可能的二级结构进行预测。

长度为70个碱基的新核酸适配体（5'-AACCGCCCGGGTCCCTAAGACTCTCCAAATCTCGCCGGCCCCGGCGCCGTACTTATGGCCCTACGCGGAT-3）.

结论：本次设计以保持它的生物学功能，提高它的稳定性和特异性识别为主要目的，在HER2靶点和核酸适配体初级同源性、二级、三级结构的认识基础上，针对肝脏肿瘤的DNA适配体进行二级结构的优化和改良，主要缩短了它的stem区，并用结合能力强的G-C配对进行碱基序列替换，设计并预测出了新适配体的二级结构，以便于后期研究。与原适配体HA5[2]相比，新适配体具有很高的结合能力，二级结构更稳定，免疫原性低、核酸序列更简洁等各种优良特点，有望在未来的应用中得到推广和发展。

关键词： 肝脏肿瘤；DNA适配体 ; 茎环结构。

Abstract

OBJECTIVE: The purpose of this study was to optimize the structure of the DNA aptamer of the HER2 protein of liver tumors, and to improve the binding properties of the aptamer to the target molecule by replacing and shortening the nucleotide composition of the aptamer. Basic theoretical work for the later clinical research.

Methods: The biological structures of DNA/RNA and antibodies were analyzed. Based on the determined nucleic acid aptamers, the target was further understood, and then the existing aptamer of HER2 was sub-classified. The optimal design of the structure was used to predict and analyze the structure of the aptamer through NCBI, as well as the software of Cylofold, etc. It was determined that the new aptamer designed this time has a more stable biological structure while maintaining the specific binding capacity.

Results: After the above shortening we replaced the original HA5[6] aptamer by 86 bases to 70, so we can adapt the new designed base sequence to the new secondary structure prediction software Cylofold. The potential secondary structure of the body is predicted.A new nucleic aptamer of 70 bases in length (5'AACCGCCCGGGTCCCTAAGACTCTCCAAATCTCGCCGGCCCCGGCGCCGTACTTATGGCCCTACGCGGAT-3).

Conclusion: This design is mainly aimed at maintaining its biological function, improving its stability and specificity recognition, based on the recognition of HER2 target and the primary homology, secondary and tertiary structure of aptamers. The optimization and improvement of the secondary structure of the DNA aptamer targeting liver tumors mainly shortened its stem region, and replaced the base sequence with a GC-binding pair with strong binding ability. The new aptamer was designed and predicted. Grade structure for later study. Compared with the original aptamer HA5 [2], the new aptamer has a very high binding capacity, a more stable secondary structure, a low immunogenicity, a more concise nucleic acid sequence and the like, and is expected to be used in future applications. Get promoted and developed.

Key words: Liver neoplasms; DNA aptamers; stem-loop structure.

目 录

第一章 绪论 6

1.1肝脏肿瘤简介 6

1.2肝癌靶向治疗的现状 7

1.3适体分子在肿瘤治疗中的应用 10

1.3.1 适配体的简介..................................................................................10

1.3.2 适配体的研究进展..........................................................................11

1.3.3 适配体分子在肿瘤治疗中的应用..................................................12

第2章 设计依据 13

2.1设计要求 13

2.2设计依据 13

2.2.1靶点的分析 13

2.2.2靶点结构分析 14

2.2.3 DNA/RNA生物学结构分析...............................................................19

2.2.4 适配体分子作用力 22

第3章 HER2结构设计 23

3.1获取HER2 23

3.2适配体的设计 23

3.2.1稳定性分析 24

3.3 适配体设计结果参数 25

第4章 后期应用手册 25

4.1 新适配体的使用方法 26

第5章 讨论 27

5.1 新适配体的评价 27

第6章 小结 28

参考文献 29

致 谢 31

第一章 绪论

1.1肝脏肿瘤简介

中国既是世界人口大国，也是肝脏病大国。我国的原发性肝癌发病率高占世界55%，死亡率达45%，肝脏肿瘤一般都是从慢性肝脏炎、肝脏硬化发展而来^[1]，起病较缓，病人早期没有明显症状，确诊时大部分已经是晚期。肝脏肿瘤的常规治疗方法无非手术治疗、介入性治疗、放射疗法、化学疗法等以及局部进行治疗（例注射无水乙醇，射频等）^[1]，这些治疗手段中只有手术切除和肝脏移植是根治手段，而且也仅仅只有约15%的患者有机会接受这两种根治性治疗，但是治疗后4年复发率高达59.9%^[1]，对于那些没能接受根治治疗的晚期患者，药物是主要手段。然而，过去的细胞毒性药物，不但疗效低，而且副作用大，因此，需要研究新的更有效的治疗手段。

临床治疗中药物的毒副作用会给病人带来巨大的痛苦，随着科技的发展，分子靶向治疗也蓬勃成长，肿瘤组织的靶向治疗是指通过操纵具备特殊针对性的靶向功能配基的介导, 将抗癌药物运输到病变部位，针对性消灭肿瘤细胞的一种治疗方法^[2]。全世界范围内对靶向给药的研究越来越火热。核酸适配体是经过体外筛选技术, 从单链寡聚核苷酸文库中得到的能特异结合蛋白或其他小分子物质的单链寡聚核苷酸，在临床诊断、靶向药物研制方面得以广泛应用。

为确保给药系统高效靶向病变细胞，靶向分子及基团的选择或设计至关重要。到目前最受关注的两类靶向分子是抗体和适配体。单克隆抗体一直作为有效的靶向分子应用于主动靶向纳米给药系统中，其中经历由全抗体的应用发展到抗体不同片段的应用等不同阶段，都以提高靶向分子的有效性为原则。但其在制备和应用中仍存在一些问题。近十年间的研究表明，作为更加小型化的靶向分子，核酸构成的适配体分子(适配体)应用得到广泛研究。核酸适配体具有可在生物体外进行化学合成，产品更加经济，易于修饰，和具有较高的稳定性等特点。核酸适配体较早主要由核糖核苷组成 (RNA 适配体)，后发展为由脱氧核糖核苷组成 (DNA 适配体)。相比较RNA适配体具有较好的三级结构特性^[2]；DNA适配体具有较好的稳定性和较为简单的筛选过程^[2]。RNA和DNA适配体都能提供和肿瘤细胞表面的抗原结合的环状结构(stem and loop)^[2]。迄今为止有不少的核酸适配体成功应用于肿瘤细胞靶向研究中；同时研究也表明核酸适配体更易于结合在肿瘤细胞表面且在体内不产生免疫原性。同时核酸适配体作为靶向分子结合在纳米载药颗粒表面还可有效地改善生物兼容性，提高稳定性和生理循环半衰期 。

1.2肝癌靶向治疗的现状

世界上每一年约598万人死于各种恶性肿瘤，中国现有癌症患者约400万人，死亡率逾28％^[3]。肿瘤的非手术治疗包括放射疗法和化学疗法，以消灭肿瘤细胞为目标，但是过于缺乏对肿瘤细胞的特异性和针对。肿瘤的靶向治疗是将药物集中在有肿瘤组织、肿瘤细胞、肿瘤基因的部位，对正常组织的副作用几乎是最低的。

而以增强的透过及滞留效应和长循环原理为机理的肿瘤组织靶向给药、 抗体介导的靶向给药系统、受体介导的靶向给药^[1]、前体药物的靶向给药、肿瘤血管的靶向给药、肿瘤靶向数字治疗的基因给药系统等，将成为肿瘤治疗的新的方向[4]。　

HER2由四个质膜结合受体酪氨酸激酶组成^[2],含有一个胞外适配体结合区、一个跨膜区和一个可与多种信号分子相互作用的胞内区，并且具有适配体依赖性和适配体依赖性的活性。HER2可以与其他三种受体异向异构，是其他ErbB受体的首选二聚化伴侣。二聚化导致酪氨酸残基在受体的胞质结构域内的自磷酸化，并启动多种信号通路。

HER2是人类表皮生长因子受体（HER/EGFR/ERBB）家族的成员^[3]。这种癌基因的扩增或过度表达在某些侵袭性肝癌的发生和发展过程中起着重要作用。近年来，该蛋白已成为一个重要的生物标志物和治疗靶点。HER2，也被称为过度表达的ERBB2基因，它与肿瘤复发增加和不良预后息息相关。过度表达也是已知的发生在卵巢，肝脏肿瘤，肺腺癌和侵袭型子宫癌。HER2大部分时间都与GRB7基因结合，GRB7是一种与乳腺、睾丸生殖细胞、胃和果蝇的肿瘤相关的原癌基因。已经证明HER2蛋白在细胞膜上形成簇，可能在肿瘤的发生过程中起作用。最近的证据表明HER2信号在抵抗EGFR靶向的抗癌药物西妥昔单抗方面起了作用。此外，结构多样。HER2因子位人体17号染色体具有跨膜酪氨酸激酶^[5]活性的受体由细胞外结构域^[5]、跨膜结构域^[5]和细胞内结构域三部分组成^[5],胞外结构域主要是由2个适配体结合域^[5]与2个富含半胱氨酸的部分^[5]构成HER2单个存在时没有活性, 只能通过形成二聚体^[5]产生活化的信号 HER2异质二聚体大大减弱了EGFR与cab1^[5]的结合, 减少了EGFR降解 ,促进EGFR因子又回到细胞膜表面,使 EGFR过度表达,加速了细胞的增长,导致肿瘤细胞的形成和加快。

目前最热门的核酸适配体，不但具有很高的特异性、与靶点的亲和力也非常强大。所以，我们认为设计一种能够针对HER2的核酸适配体是靶向治疗肝癌的新的可能和新的方向^[6]。

HER2蛋白的过表达和肝癌的发生发展密切相关,他的适配体可以作为一种重要的靶向分子应用于肝脏肿瘤的诊断和治疗^[6]在靶向载体工具中的应用日渐增多，利用筛选到的全新的HER2适配体HA5^[6],通过把适配体与药物载体或诊断试剂结合起来，HER2的适配体有可能在多种HER2阳性肿瘤的靶向诊疗方面具有较为重要的应用潜能。

HA5^[6]的序列：5'-AACCGCCCAAATCCCTAAGACTCTCCAAATCTCTCCTTCCCCTTCTCCGTACTTATGGCAATACACAGACACACTACACACGCACA-3'。

图13：通过Cylofold预测的HA5^[6]的二级结构。

1.3适配体分子在肿瘤治疗中的应用

1.3.1 适配体的简介

核酸适配体，指通过在DNA/RNA 文库中各种筛选方法得到的，一种具有高度亲合和高度特异性的与各种特定靶标结合的单链寡核苷酸片段，核酸适配体大概由十到一百个碱基^[3]组成，当它与靶标结合时，通常都是通过碱基配对形成稳定、固定的二级结构与靶标结合，进而形成更加稳定的二级结构，比如茎环、假结、G-四聚体^[3]等，这些结构中的碱基往往是与靶标结合的关键位点^[7]。核酸适配体与抗体相比而言具有明显优势，比如：

（1）抗体要通过动物体内获取，而核酸适配体可以在体外筛选获得。

（2）核酸适配体性质稳定。蛋白质在构建生物传感器时会由于化学和物理性质不稳定而容易失活，而核酸适配体在强烈高温下^[6]都不会变性或被破坏，在 p H 2-12 的酸碱范围内也能保持稳定结构，在构建生物传感器中有很大的发展前景。

（3）核酸适配体较容易合成。核酸适配体通过化学方法就可以获得，制备比较快速、成本更低。核酸适配体还可以用来进行功能化设计等操作^[4]，比如进行荧光标记或者酶标记，同时还能进一步提高靶向分子的生物稳定性等。

（4）能通过碱基互补配对的改变，进而设计核酸适配体结构。与抗体相比核酸适配体拥有简单的碱基构成，且有可供参考的碱基配对法则，即使它的组成在一定程度上限制了特异性识别，但是，这不影响核酸适配体的比较方便设计优化。

（5）核酸适配体还具有其他的优点。核酸适配体相对分子量M小，体积也不大，不存在免疫原性，组织渗透性好^[7]，靶标可以是小离子，小型分子，蛋白质类，生物细胞，细菌，病毒等。而所有这些适体可以为RNA、单链 DNA、双链DNA 等各型的寡核苷酸，还可以为肽适体，性质也都不一样。

1.3.2 适配体的研究进展

第一个用于治疗黄斑变性的核酸适配体药物哌加他尼钠通过了美国FDA药物检测^[8],这使得适配体药物的研究更上一层楼。核酸适配体可以应用于疾病的治疗,还可以作为辅助药物与其他药物一起使用，除此之外，还具有其他几种特点：

适配体具有靶点定位功能^[5]

人类基因组被成功解析,使得核酸药物靶点成为可能。药物研究告别了确定药物的靶点蛋白,还要依靠生物方法来实现。利用核酸适配体能与靶蛋白特异性结合的特点,使得它可以成为很好的药物靶点定位的新方法。

能够筛选药物

核酸适配体与靶序列能够特异性的结合,使它能够作为筛选药物的重要工具。在对靶物质进行高通量的药物筛选时^[6],如果使用核酸适配体为主要标记物,待检测的小分子会取代适配体与靶序列结合,使得它具有针对此靶序列的药物的可能性。而且核酸适配体分子比较容易进行修饰改造,比如使用荧光等方法。

能够运输药物

现如今有报道为了让适配体具有细胞选择性将适配体^[6]连接在 siRNA 药物上面。如果需要增加其选择性和运输能力，它还可以连接在毒素等物质上,同位素或者化学治疗药物上。它的这种功能不但能避免药物伤害其他细胞和组织, 还能减少药物的用量。

适配体在治疗学领域的研究进展

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