摘 要

生物磁感应现象是生物学和物理学交叉领域内的一个有趣且重要的现象。光磁耦合蛋白复合物Cry/MagR作为目前最有希望的磁蛋白候选者，为解释生物磁感应现象提供了一种的可能途径。然而磁蛋白接受到光磁信号之后是如何传递化学和神经信号从而影响动物行为模式的，还有待研究。Cry和MagR又分别在生物节律调控上面起到了关键性的作用。本文探究其复合物在原核表达中对大肠杆菌生长速度或者是细胞命运的调控；以及MagR功能域是否参与其调控过程中。结果表明磁蛋白复合物的确起到调控细菌生长周期的作用，并且也证实了功能域也参与到其中。通过进一步研究有可能揭示磁蛋白在动物体内是如何感应光和磁场信号，并影响动物生理生化以及行为模式的；还将可能提供解释临床上对抑郁症患者使用光磁疗法的有效性。

关键词：光磁耦合；磁感应；Cry/MagR；生物节律；细胞命运；

Abstract

Biological magnetic induction is an intriguing and important phenomenon in the intersection of biology and physics. As the most promising candidate for magnetic protein at present, the photo-magnetic coupling protein complex Cry/MagR provides a possible way to explain the phenomenon of biological magnetic induction. However, it is still a mystery how magnetic proteins can transmit chemical and neural signals to affect animal behavior patterns after receiving magneto-optical signals. Both Cry and MagR play key roles in the regulation of biorhythm. In this paper, the regulation of its complex on the growth rate of E. coli or cell fate in prokaryotic expression was investigated. And whether MagR functional domains are involved in its regulation process. The results showed that the magnetic protein complex did play a role in regulating the growth cycle of bacteria, and the functional domain was also involved. Further research may reveal how magnetic proteins in animals sense light and magnetic signals and influence physiological, biochemical and behavioral patterns. It will also be possible to explain the clinical efficacy of photo and magnetic therapy in patients with depression.

Keywords: photo-magnetic coupling; magnetic induction; biological rhythm; cell fate;

目录

摘 要 I

Abstract II

1. 绪论 1

1.1. 生物磁感应现象 1

1.2. 生物磁感应机理研究 1

1.2.1. 磁铁矿假说 1

1.2.2. 基于由Cry自由基对的量子罗盘假说 1

1.2.3. 基于Cry/MagR的生物指南针假说 2

1.2.4. 存在的问题分析 2

1.3. 影响细菌生长的主要因素 3

1.3.1 光对细菌生长情况的影响 4

1.3.2 磁场对细菌生长情况的影响 4

1.4. 研究目的及意义 4

1.4.1. 研究目的 4

1.4.2. 研究内容 4

1.4.3. 研究意义 4

2. 材料和方法 4

2.1. 仪器和设备 4

2.2. 材料试剂 6

2.3. 实验方法 7

2.3.1. 设计合成引物 7

2.3.2. PCR扩增片段 8

2.3.3. 琼脂糖凝胶电泳 9

2.3.4. 酶切连接 9

2.3.5. 感受态细胞制备 9

2.3.6. 质粒转化 10

2.3.7. 原核诱导表达 10

2.3.8. 超声破碎 10

2.3.9. Ni-NTA亲和层析 11

2.3.14. TEM电镜制样 16

2.3.15. 点菌落 16

3. Cry/MagR的表达对原核生长影响 17

3.1. 引言 17

3.2. 相关表达载体构建 17

3.2.1. pET-28a-dpCry-dpMagR 17

3.3. 生长情况比较 18

3.4. 小结 24

4. MagR功能域对原核生长影响 24

4.1. 引言 24

4.2. 相关表达载体构建 24

4.2.1. pETduet-1(blank) 24

4.2.2. pETduet-clCry-clMagR (WT) 25

4.2.3. pETduet-clCry-clMagR (3M) 29

4.3. 生长情况比较 31

4.3.1. 条件设置 31

4.3.2. 生长情况比较结果 31

4.4. 统计分析 32

4.5. 小结 33

5. Cry/MagR蛋白表达纯化及TEM观察 34

5.1. 引言 34

5.2. 磁珠纯化 34

5.2.1. 磁珠纯化样品SDS-PAGE电泳 34

5.3. 亲和层析 35

5.4. 凝胶过滤 37

5.5. TEM观察 38

5.6. 小结 40

6. 结果及展望 41

6.1. 结果讨论 41

6.2. 展望 42

致谢 43

参考文献 44

1. 绪论
   1. 生物磁感应现象

动物的磁感应现象可以归纳为两大类：（1）磁场导航（2）磁场排列。

磁场导航（magnetic navigation），包括迁徙（migration）和归巢行为（homing）。鸟类的迁徙是指鸟类种群在其夏天繁殖区和越冬区之间所进行的一种大规模的、有规律的、广泛的和季节性的运动。这种运动的基本特点是定期和定向并且常常集成大群进行。

磁场排列（magnetic alignment），也即身体方向或者巢穴取向依据磁场而定等等。这些现象目前被认为是因为生物能够感应地磁场。

• 1. 生物磁感应机理研究

德国的Wolfgang amp; Roswitha Wiltschko 夫妇用实验证实磁场影响鸟类的迁飞^{[1, 2]}，其后10年逐渐被多个实验室重复，并进一步发现光在动物感磁中是必要的因素，从而确立了磁场在生物导航中的关键作用以及动物磁导航中的光磁耦合现象^[3]。经历一百多年的发展，目前关于磁感应现象的机制，主要有三大假说。

• • 1. 磁铁矿假说

磁铁矿假说比较直观，认为动物体内存在磁铁矿（铁磁性颗粒），构成了磁感应的物质基础，动物通过这些铁磁性颗粒感知地磁场并用于导航。这一假说最初源于对趋磁细菌的研究随后研究者在鸽子^[4][5]，知更鸟^[6]等许多鸟类的喙以及蜜蜂^[7]，大马哈鱼^[8]等动物体内发现了含铁磁性颗粒。所有这些发现使得人们非常容易由趋磁细菌的例子推而广之，认为动物体内的含铁磁性颗粒如同趋磁细菌中的磁小体一样，构成了感磁的物质基础。

• • 1. 基于由Cry自由基对的量子罗盘假说

基于自由基对的量子罗盘假说最早由理论物理学家Klaus Schulten在1978年提出，试图从物理化学的角度来解决生物何以感知微弱的地磁场的问题^[9]。他认为基于相干电子自旋运动可以被磁场调控，两个分子间的电子传递导致两个未配对的电子处于单重态，在量子力学中，初始的单重态通过电子自旋和核自旋的超精细相互作用耦合到简并三重态，而从头单重态到三重态的速率受到磁场影响。假定自由基对在单重态和三重态情况下的反应产物不同，则微弱的地磁场可以影响这样的化学反应。他认为鸟类在磁导航有可能依赖于这样的一个量子罗盘。而生物体内一种对蓝光敏感的感光蛋白Cryptochrome（隐花色素简称Cry）在这一假说中被认为是可能的磁感应受体^[10]。这一假说在Thorsten Ritz^[11-13]、Peter Hore^[14]等物理学家的努力下逐渐改进并得到了生物学家较多实验的支持，成为了量子生物学的一个经典范例。

• • 1. 基于Cry/MagR的生物指南针假说

多年以来，以上两大假说一直在争斗不休，在斗争中分别得到了一系列实验证据的支持，但如前所述，也都存在一些致命的问题。时间进展到了2015-2016年，谢灿课题组通过理论模型构建以及基因组筛查后，提出另一种可能，试图融合了量子罗盘和光磁耦合机理中的一些关键元素^[15]。该假说认为在量子罗盘假说中认定的Cry并不是真正的磁受体，而是光磁耦合机制中的感光部分，进一步推测在动物体内存在一个具有內禀磁性的蛋白，才是真正的磁受体（MagR，Magnetic Receptor or Magnetoreceptor）。它能够与光激活的Cry结合形成光磁耦合的复合物，实现对磁场方向，强度和磁倾角的检测，这一纳米级的生物指南针构成了动物感磁和磁导航的基础。根据这一理论推测模型，运用全基因组筛选方式，结合生物化学和生物物理学实验，首次发现了动物对磁场感知的磁受体（MagR）和MagR/Cry光磁复合物。这一发现和假说引起了国际上的广泛关注和激烈讨论，包括许多来自量子罗盘领域科学家的支持。目前牛津大学的Peter Hore认为这是一个值得进一步检验的模型，他认为未来应该聚焦于这一模型中感光受体Cry和感磁受体MagR之间的关系以及基于Cry的量子罗盘在其中所起的作用。中国工程物理研究院的孙昌璞认为MagR的內禀磁性形成的局部非均匀磁场，可能影响到Cry的量子纠缠态，从而构成了光磁耦合的量子模型，有可能解决了量子罗盘中遗留的方向辨识问题。

• • 1. 存在的问题分析

磁铁矿假说的问题：显而易见的是，将这些铁磁性颗粒作为动物感知地磁场的物质基础这一假说相对直观且符合经典物理学的常识。然而，物理上的自洽并不能让生物学家信服，首先，从生物学的视野来看，很难想象无机的磁铁矿如何和细胞信号通路（如激酶或者细胞膜上的离子通道）相偶联；其次，铁磁性颗粒并不能提供对光磁耦合机制的解释；况且，铁作为生物体中最为丰富的金属元素，在生物体的很多组织中甚至包括大脑和神经系统中找到无机的铁磁性颗粒的存在并不困难，但如何证明这些铁矿石的存在和磁感应直接相关则是难如登天。曾经几乎被办成了“铁案”的鸽子鸟喙中的铁磁性颗粒被否定和磁感应有关即是一例，因为那些细胞是与免疫相关的巨噬细胞，而不是曾经被认定的“神经细胞”。

基于Cry自由基对假说的问题：这一假说得到了许多证据包括动物行为学以及物理化学证据的支持。有意思的是，它脱胎于纯粹的量子物理理论推测，然而恰恰也受限于理论的局限性，比如说，从理论上无法解释量子罗盘如何实现对磁场方向的识别，从实践上也没有提供如何将这一微弱的信号放大到能让动物感知的机理。但量子罗盘假说无疑是一个磁感应领域中一个好的开始和研究方向，亟待完善。

基于MagR的生物指南针假说的问题：这一假说有非常明确的物质基础（感磁的MagR蛋白和感光的Cry蛋白）和无限的理论推演的可能性，如果这一模型是正确的，那么它可以回答动物磁导航中几乎所有的问题。然而，这一假说主要的证据来源于体外的蛋白质机理研究和理论推导，还有待更多生物学实验的证实；同时，光磁耦合模型的很多细节，包括从分子原子乃至量子水平去理解蛋白质的磁矩，以及光磁如何实现耦合都有赖于进一步去揭示。生物指南针假说在发表两年内的文章引用近80次，Meister通过理论推导对这一工作进行质疑^[16]；或独立的验证、激烈的讨论，并试图完善这一假说（Jiang et al. 2017, Sci Rep^[17]; Zhang et al. 2017, arXiv^[18]; Clites and Pierce, 2017, Annu. Rev. Neurosci^.[19]; Cao et al. 2018^[20]），并将MagR的磁性成功地作为磁性标签使用进行蛋白质纯化和相关的应用^[17]。

这些假说都试图从分子的层面上去理解或阐释生物磁感应现象的机制，但在本文中依据的是第三个也就是基于Cry/MagR复合物的假说。Cry接受到的光信号和MagR接收到的磁信号之间是如何耦合的，这个问题本文暂时回答不了。之后是如何传递化学和神经信号从而影响动物行为模式的，这是本文尝试去回答的问题。Cry因为在生物节律的调控方面已有大量相关研究早已被人所熟识^[21-24]；然而也有独立的关于MagR也就是IscA1 (CG8198)，对果蝇节律影响的研究被报道^[25]。基于已有这些的研究，我拟定探究Cry/MagR蛋白复合物功能是如何影响生物节律的，为研究简易起见，初步探索所选取的研究生物对象为原核生物。

• 1. 影响细菌生长的主要因素

影响细菌生长的因素有很多：环境的温度，pH，光照，磁场，营养物质等等。但因为磁感应现象是被证明是光磁耦合的，于是在这里我们主要探究光照（可见光）和磁场对细菌生长情况的影响。

1.3.1 光对细菌生长情况的影响

可见光，不相干或相干的红光对细菌生长有刺激作用^[26]；紫外光可以通过引起细菌基因突变^[27]导致细菌生长也会受到很大影响。

1.3.2 磁场对细菌生长情况的影响

存在有趋磁细菌^[28]在磁场下能够响应磁场变化而集体移动；有研究和方法利用磁性纳米材料对细胞命运调控^[29]以及对细胞进行操控^[30]；以及磁性纳米材料在生物医学领域也有应用前景^[31]。

• 1. 研究目的及意义
     1. 研究目的

鉴于磁感应蛋白的化学信号的传递与生物行为模式的联系还没研究清楚，本文主要探究Cry/MagR 光磁耦合复合物原核表达对大肠杆菌生长生理的影响；以及MagR功能域是否在大肠杆菌生长生理过程中起到调控作用。

• • 1. 研究内容

Cry/MagR复合物的表达对原核生物生长影响；MagR功能域突变和野生型对原核生长影响差异；Cry/MagR纯化和TEM观察。

• • 1. 研究意义

通过对磁感应蛋白复合物Cry/MagR在原核生物中在生理或细胞周期调控作用的初步探究，进一步可以进行信号通路的详细研究；以及在真核生物，哺乳动物中进行探究蛋白复合物是如何作用于真核细胞；通过在分子水平上的研究，例如探究磁蛋白Cry/MagR复合物与神经递质的相互作用的可能。提供了一条可能的用来揭示磁蛋白在动物体内是如何感受光和磁场并通过神经，化学信号传导使动物实时感应地球磁场并改变自己的行为模式的研究道路和方向。

1. 材料和方法
   1. 仪器和设备

本文中所用到的仪器设备如表2.1所示。

表2.1 仪器设备

• 1. 材料试剂

本文中所用到的材料试剂如表2.2所示。

表2.2 材料试剂

• 1. 实验方法
     1. 设计合成引物

引物设计使用的SnapGene软件：

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