摘 要

第一章 绪论 4

1.1研究背景及研究现状 4

1.1.1研究背景 4

1.2 国内外研究现状 5

1.2.1 PHA的结构与特性 5

1.2.2 促进PHA合成的宏观因素 7

1.2.3 PHA合成的影响因素 7

1.3 课题研究目的及研究内容 10

1.3.1 课题研究目的 10

1.3.2 课题研究技术路线 11

1.3.3 课题研究内容 11

第二章 实验材料与方法 12

2.1 实验装置与运行方式 12

2.1.1 实验装置 12

2.1.2 实验用水与接种污泥 13

2.1.3实验试剂 14

2.1.4实验设备 15

2.2 实验方法 15

2.2.1 PHA检测方法的选择 15

2.2.2 色谱条件 17

第三章 结果与讨论 17

3.1物质标准曲线 17

3.2 污泥样品中PHA的种类 18

3.3 PHA含量随时间变化情况 20

3.3.1 气相色谱图中PHB含量随时间变化关系 20

3.3.2 气相色谱图中PHV含量变化与时间的关系 23

致 谢 26

参考文献 26

摘 要

聚羟基烷酸脂（PHA）是一种脂类物质，是由微生物在不均衡的营养条件下生成的，在微生物的代谢中起到极其重要的作用，包括积累碳源、平衡细胞内外离子等。PHA的物理性质与聚丙烯等化学塑料十分相似，但是它无毒无害，在自然界也可以完全降解，是一种可以替代化学塑料、解决白色污染的优秀材料；但是却因为高昂的成本无法大规模的推广和应用。使用如活性污泥中的混合菌种代替纯菌，含脂肪酸的废水代替葡萄糖、果糖作为底物等方法不仅可以降低PHA的生产成本，还可以达到污泥减量、废水重复利用等目的。可以合成PHA的细菌种类有很多，所以利用活性污泥作为混合菌基质合成PHA受到了来自全世界的广泛关注，然而目前为止利用活性污泥合成PHA的工艺十分复杂，将富集和驯化污泥合成PHA在两个反应器内分成两个阶段分别进行，总工艺时间相对漫长，PHA 合成的效率也不是很高。其中聚-13-羟基丁酸酯(Polyhydrobutyrate，简称PHB)则是PHA的一种；PHB同样是许多微生物的胞内碳源储藏性物质。PHB作为一种可降解的生物塑料，它不仅具有高分子材料具有的热塑性，还能作为可再生生物资源提供生产原料，因而倍受关注。活性污泥中的许多细菌都能生成PHB，如何利用污水处理过程中的剩余污泥去合成PHB，是研究生物合成的一个热点，也为剩余污泥资源化提供了一种新思路。

本课题的研究目的是找出CPAM存在条件下PHA产生量的变化，通过实验找出PHB的浓度随时间变化的情况。

试验在添加CPAM的条件下接种活性污泥，使用SBR反应器，使用厌氧-好氧工艺合成PHA。研究发现PHB的浓度随时间变化不断上下起伏，并在某一时间点达到一个最高值之后逐渐下降到一个极低的水平。

试验还研究了样品中PHA的种类，发现在CPAM存在条件下活性污泥中的PHA的主要产物为PHB,次要产物为PHV；并对PHV的含量随时间变化进行了一定的研究，发现PHV的含量变化与PHB相类似，但比PHB变化更为明显。

关键词：聚羟基烷酸脂，聚-13-羟基丁酸酯，活性污泥，CPAM，气相色谱法，浓度与时间的关系

第一章 绪论

1.1研究背景及研究现状

1.1.1研究背景

“白色污染”是塑料制品的一种称谓，主要包括各种塑料制品，它们由聚乙烯、聚丙烯以及聚苯乙烯、聚氯乙烯等来源于石油化工工业中的高分子化合物制成，不仅难以降解，而且污染环境，这其中以塑料袋的熟料最多。随着石油工业的日益发展，人们生活的每个角落都充斥着塑料制品，越来越多的“白色污染”业导致了许多不容忽视的问题：

（1）侵占土地。塑料类垃圾在自然界几乎无法降解，停留可达数百年的时间。大量土地甚至良田被越来越多的塑料垃圾占据。

（2）污染空气和水体，严重破坏生态环境。焚烧塑料制品会产生有害有毒气体，若漂浮在水体则会形成死角滋生蚊蝇；塑料袋若被动物误食，甚至会因为无法消化而致死。

（3）废旧塑料的包装物一旦进入环境便会造成长期的、更深层次的环境问题。混在土壤中会影响农作物的吸收，甚至导致农作物的减产；在大量使用地膜覆盖生产的农村地区这个现象更为严重。

“白色污染”造成了极大的环境问题，也大大加剧了石油资源的消耗。而解决问题的关键在于：一方面着手提高民众的环保意识，减少生活中对塑料袋依赖，同时提倡塑料袋的回收利用；另一方面加快可降解塑料的推广和普及，降低可降解塑料的生产成本，从源头上减少污染。

目前常见的可降解塑料常常指的是在生产的过程中加入一些添加剂（如淀粉或其它纤维素等）降低塑料制品的稳定性，使其在自然环境中更容易降解，但这种塑料并不能完全可降解，只是在自然界条件下变成了更小的塑料碎片；残留的碎片仍然无法降解。因此，研究完全可降解塑料始终是一个热点。

聚羟基烷酸脂（Polyhydroxyalkanoates，简称PHAs或 PHA）是一中存储在细胞内的碳源物质，当原核微生物存活在缺乏氮源、磷源生长条件下时才会合成，不仅化学、物理性质与塑料基本一致，还无毒无害；更重要的是PHA可以被微生物在自然界中完全分解利用，拥有良好的生物相容性，所以是一种很有前景的新型环保材料，今年来也成为生物技术研究领域的一个热点。然而，目前生产PHA主要依靠纯菌培养发酵，例如用Alcaligenes latus合成的 Biomer™ ， Burkholderia sacchari合成的 Biocycle™。利用纯菌发酵的方式通常使用纯度较高的糖类作为基质，培养条件苛刻，使PHA的成本也大大增加，相比于石化塑料价格高得多，所以仅应用于少数领域。一些研究为了提高PHA的合成效率尝试着寻找新的微生物菌或者寻找更有效的工艺来。从现已有的研究表明，PHA是污水处理工艺中生物除磷工艺中的重要代谢产物，所以利用混合菌以污泥作为碳源进行PHA的合成是完全可以的。

城市污水处理厂主要的生物处理工艺核心是活性污泥，它是包含了细菌、真菌、原生/后生动物等多种繁杂微生物的体系。城市在处理污水的过程中，处理每1立方米污水就会产生约0.6kg的脱水污泥，这其中有80%没有得到处理，同时会造成二次污染；将污泥填埋或焚烧也是对资源的浪费。因此，污泥减量、重复利用污泥也将成为人们近年来关注的热点。

若能将剩余活性污泥作为碳源来培养混合菌种，通过一套工艺条件将菌种驯化，使其可以利用高浓度有机废水为底物在细胞内生成PHA，首先可以使污泥得到资源化利用，还具有废水处理、碳源的回收等功效。

1.2 国内外研究现状

1.2.1 PHA的结构与特性

20 世纪初，一种用于氯仿、亲苏丹染料的化合物在一种固氮细菌中被发现了，随后在一种杆菌中也分离出了相同的物质，同时鉴定了结构，命名为聚-3 羟基丁酸；1974 年，Wallen和Rohwedder在活性污泥的提取物中发现了不同种类的PHA，命名为3-羟基戊酸和3-羟基己酸，随后发现越来越多的 PHA 结构，截止1988年，各种菌体中发现的PHA的种类已经超过120种，目前更多的PHA结构也正在被不断的发现。

PHA在微生物体中通过一系列复杂代谢途径积累，PHA不溶于水，分子量较高，pH呈中性，因此在细胞内环境中可以保持较好的稳定性，通过合成和分解PHA可以实现能量的转换，因此是良好的储能物质。目前已有的研究表明，在营养相对匮乏、碳源相对充足的情况下，细菌缺乏营养不能分裂生殖快速生长，会在细胞内积累PHA。除此之外，PHA还具有其他很多方面的生理功能，例如提高微生物对环境变化的抵抗能力，调控代谢、氧化还原反应等。

PHA在空气中保持稳定的物理和化学性质，单纯的潮湿条件同样对PHA性质也多大的影响；但PHA在自然界的土壤和水体中却可以发生降解作用。Aamer等人的研究认为PHA分解的过程受到来自土壤或水体中细菌的种类和分布情况的影响，研究者尝试着将一种PHBV的薄膜与湿污泥混合之后埋在一起，120天后PHBV的薄膜发生了明显的断裂；而Brandl在研究一种由PHB和PHV共聚物在85m深的自然水体中降解时发现，250天后PHB-co-PHV的质量降低到90%；Woolnough的研究则发现92%的PHB和8%的PHV共聚薄膜埋藏在在花园土壤中50天后，质量降低到了50%，而聚羟基辛酸脂薄膜则被降解了60%，研究同时发现，材料的表面粗糙度会影响PHA的降解能力。

就PHA在自然条件下的稳定性而言,这种材料具有广泛的应用范围,可以替代一次性塑料袋和一次性塑料制品。

PHA物理性能也因其结构差异而呈现出了差别，表1-1列出了不同单体构成的 PHA与化学塑料之间物理性能的比较：

表 1-1 PHA与化学塑料的物理性能

Tab.1-1 Physical properties of PHA in comparison with chemical plastics

从表1-1中可以看出，单纯的PHB脆性高，延展性不好，不过当它与其他成分形成共聚物后，其性能将获得较大改善。PHB是微生物合成的聚脂类化合物中最常见的，许多种细菌都可以合成。

本次试验中PHA的产物主要以PHB为主，所以测量PHA产量变化的时候会通过测量PHB的含量来表达变化情况。

1.2.2 促进PHA合成的宏观因素

通过纯菌发酵培养PHA需要试验测定其发酵参数，但是对于混合菌而言，积累PHA则需要通过一些其他的条件来实现；一般来说，易于混合菌PHA合成的是不均衡的营养条件，这其中可分为两类：一是基质浓度在时间上存在较高的梯度，如SBR工艺；二是基质浓度在空间上存在较高的梯度，如推流式反应系统或者空间上存在“饱食”与“饥饿”相互交替的生态环境如强化生物除磷系统等。

与此同时，微生物的生长也是一个不稳定的的过程；当底物丰富时（如SBR进水初期、或投加底物的瞬间），微生物可以同时进行生长、增殖以及积累体内能源物质；当底物匮乏时，则会通过消耗体内能源物质来提供碳源和能量，维持自身的代谢。一段周期之后，可以存储细胞内碳源和能源物质的微生物将会更具有竞争优势。对于时间上存在基质梯度系统，投加底物后，微生物群落会对底物进行争夺和利用；给予足够的好氧时间之后，无法存储细胞内能源和碳源物质的微生物自身将会发生氧化作用，更加加速了菌种的淘汰，也加快了反应器内群落的演替；可以快速积累碳源的微生物则逐步占据了优势地位，但是与此同时，以这种生长方式生存的微生物，吸收对外碳源不仅仅只用于自身生长繁殖，因此生长速率相对来说也比较低。

综合来看，具有合成PHA能力的微生物，应具有如下特征：

1. 在基质充盈的条件下，可以快速摄取外碳源并将其积累为自身的内存物质；

（2）在基质匮乏条件下，细胞内存储的能源物质又可以作为内碳源和能量源去消耗。

1.2.3 PHA合成的影响因素

1.2.3.1 营养比例的影响

Rhu等使用SBR研究了限制溶解氧及营养元素条件下活性污泥积累PHA的情况，结果表明，在磷限制的条件下，厌氧-好氧的运行方式最大可以积累PHA的量占细胞干重的51%，PHA的组分主要是PHB与PHV，其含量之比取决于乙酸钠的含量，限磷比限氮更有利于PHA的积累。而 Chinwetkitvanich等研究了磷缺乏和温度对PHA产率的影响，研究表明磷限制条件下积累PHA的速度比氮限制条件下要慢，在第一次限制磷至26天时PHA最大积累量达到细胞干重的47%。

一般认为高的C/N有利于PHA的合成，C/N越高，微生物中PHA的含量也就越高。但Dionisi等的研究发现，在好氧瞬时供料条件，通过在比较限氮条件下和氮过量条件下的动态供料合成实验，发现在限氮条件下PHA的合成量没有显著提高，他们认为这是因为富集阶段对PHA合成菌的筛分作用很关键，在动态供料的体系中筛分出来的合成菌在 PHA 合成阶段对氮源的变化不敏感所致。

1.2.3.2 pH 值的影响

Serafim等发现，若反应过程中对pH不进行任何控制，PHB的最大合成量可达到细胞干重的47.5%，若将pH值控制为7.0和8.3时，PHA的最大合成量仅为细胞干重的27.5%和39.8%。据此，Serafim认为在不控制pH值或控制pH值在较高的情况下，可以相应的提高PHA产量。也有试验表明，在不控制pH值的时候，仅有约12%的基质供微生物代谢活动，大部分的底物被微生物用于生长和存储；当控制pH值在7.0时，则约有44%的底物用来提供微生物生命活动时所需要的能量，只有约一半的量用于生长和碳源存储。但是从经济的角度来考虑，不控制pH值将大大减少工艺的复杂性和运行费用。

1.2.3.3温度的影响

Krishna等研究了在15、20、25、30和35℃温度条件下，SBR中的污泥的基质储存情况，结果则显示随着温度的升高PHB的生成速率反而降低，这可能因为升高温度会提高微生物的同化速率。

Chinwetkitvanich等早研究了10℃、20℃、30℃三种温度梯度下的PHA合成情况后表明，10℃时合成的PHA更多，而在20℃和30℃时，PHA的产量则没有太大差别；三种温度下PHA的最高产量分别达到污泥干重的 52%、45%、47%。

1.2.3.4 阳离子聚丙烯酰胺

CPAM即阳离子聚丙烯酰胺，该物质具有多种活泼基团， 与许多物质都会亲和、吸附形成氢键。主要是絮凝状胶体并带有负电荷；具有除浊、脱色、吸附、粘合等功能，特别适合城市污水、城市污泥、造纸污泥及其它工业污泥的脱水处理。主要用途包括以下几种：

（1）污泥脱水剂

城市与工业污水常用活化污泥法处理，生化污泥是亲水性很强的胶体，正因为有机含量高，所以极难脱水。可以根据污泥性质可选用相应的阳离子，可有效使污泥进入压滤之前进行重力污泥脱水，脱水效率高。

（2）污水和有机废水的处理

在酸性和碱性介质中均呈阳电性，对污水中悬浮颗粒袋阴电荷的污水进行絮凝沉淀或者澄清都是极为有效的。

（3）用于以江河作水源的自来水厂的水处理絮凝剂

用量少，效果好，成本低。与无机絮凝剂复配使用效果更好。是沿长江、黄河、淮河及其他河流流域的水厂的高效絮凝剂。

（4）油田化学剂

如粘土防膨剂，油田酸化用稠化剂等。

（5）造纸助剂

在造纸行业中，起到增强，助留，助滤的目的；可以有效地提高成纸的强度。还可以用于白水处理，在脱墨过程中也能明显的絮凝。

1.2.3.5 PHA主要合成工艺

本文中的PHA主要合成工艺为厌氧-好氧工艺。而厌氧～好氧体系早在1970年就已经被提出了，如今已经是一个广泛应用于污水除磷的体系，也是目前被普遍认可的生物除磷的机理.

先将细菌置于厌氧的状态下，使细菌排除体内积累多聚磷酸盐，然后放入含有充分溶氧和丰富有机污染物的废水中，使细菌充分且快速地吸收有机物和可溶性磷酸盐，并将过多的磷积累于自身体内，然后将含有这种细菌菌体的活性污泥立即在沉降池内沉降，派出已经取得良好除磷效果的上清液，排除一部分沉降的污泥作为剩余污泥，另一部分返回厌氧池，并重复上述过程。

1.2.3.6 活性污泥的主要性质

对有有机污染物的污水进行连续的曝气，就能够增殖大量的好氧微生物，这些增殖的好氧微生物会与水中的固体物质形成绒粒，沉积之后如泥状。如将这种污泥收集起来并投加到新鲜污水中继续增殖，那么微生物吸收有机污染物的速度大大提高，这一过程中形成了充满微生物的污泥即为活性污泥。

以好氧菌为主体所形成的绒粒就叫做活性污泥，包含废水中的有机及无机的悬浮或胶体物质，表面上附着各种各样的原生以及后生动物，是一种及其复杂的体系。各种活性污泥由于水质、介质以及工艺的不同，其中的差别也非常大。许多研究者对各种活性污泥成分进行分析的结果表明活性污泥具有较接近的化学组成，通式写作：C5H7N02。目前还无法精确计算活性细胞的数量，由于微生物是固相，就常用混合液的悬浮固体(即MLSS)中挥发固体(即vss)的重量就假定近似的等于活性细胞数量。两者不同之处是悬浮固体中有一部分无机物质，因此挥发固体接近于实际情况。但还是有一些非活性的物质灼烧时形成的减量也被认为是有机物质。在一般情况下，活性污泥中的挥发固体在悬浮固体中大体上有一定的比例，两者可以互相换算，如生活污水处理的活性污泥中挥发固体约为悬浮固体的60-80％，其中工业废水中纯化学物质较多，还会大于此值。用悬浮固体或挥发固体来估算活性污泥中的活性细胞数目，即使比较粗略，但由于操作简单，在工业上仍然普遍采用。

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