摘 要

本研究收集荚蒾属药用植物，通过提取总基因组DNA，扩增聚合酶链反应（PCR）并进行测序，然后进行序列变异分析和NJ树聚类分析，并使用NCBI的基本局部比对搜索工具（BLAST）进行荚蒾属药用植物的物种鉴定。运用DNA条形码技术对物种进行快速、准确识别，所得结果对于鉴定荚蒾属植物具有重要的指导意义。研究结果表明：荚蒾属种内最大K2P距离小于其种间最小K2P距离，在NJ聚类树上荚蒾属不同种植物分别聚为独立的分支。所以ITS2作为DNA条形码可以鉴定荚蒾属植物，应用DNA条形码技术可以对荚蒾属植物进行快速有效的鉴定，

关键词：荚蒾属植物；DNA条形码技术；ITS2；鉴定

Abstract

In this paper, we first collected the DNA from the raw materials and the original plant samples, obtained the DNA bar-coding sequence, using DNA bar-coding techniques.The species is identified by using one or more short DNA segments as bar-coding quickly and accurately.The results for the identification of plants of the genus Viburnum have important guiding significance.Thesis mainly studied the plants of the genus Viburnum DNA bar-coding technology appraisal method.The results showed that the application of DNA bar-coding technique was used to identify the plants, and the safety and efficacy of the medicinal materials were obtained.

The characteristics of this paper: the detection of DNA sequence as the detection object, expanded the detection sample range. It can be used for non-expert species identification. It is high in accuracy.By establishing DNA bar-coding database, a large number of samples can be quickly identified.

Key Words：Viburnum；DNA bar-coding；ITS2；identification

目录

第1章 绪论 1

1.1 荚蒾属植物的研究与利用 1

1.2 DNA条形码技术 3

1.3 研究的内容与目标 4

1.4 研究的目的与意义 4

第2章 荚蒾属植物的DNA条形码鉴定研究实验方法 6

2.1 实验原理 6

2.1.1 DNA提取原理 6

2.1.2 PCR原理 7

2.1.3 测序原理 7

2.2 试验样品与来源 8

2.3 试剂及仪器 10

2.4 实验步骤 12

2.4.1 样品前处理 12

2.4.2 基因组DNA的提取 12

2.4.3 PCR扩增 15

2.4.4 琼脂糖凝胶电泳 16

2.4.5 数据处理及软件应用 17

2.5 荚蒾属DNA条形码提取结果与扩增结果分析 18

2.5.1 DNA提取结果 18

2.5.2 PCR扩增结果 18

2.6 荚蒾属DNA条形码序列分析 18

2.6.1 荚蒾属药用植物变异位点分析 18

2.6.2 荚蒾属药用植物种间变异分析 25

2.6.3 荚蒾属药用植物种间序列聚类分析 27

第3章 结论与讨论 29

3.1 结论 29

3.2 关于本实验的讨论 29

参考文献 30

致 谢 32

第1章 绪论

1.1 荚蒾属植物的研究与利用

荚蒾属（拉丁学名：Viburnum Linn.），被子植物门双子叶植物纲合瓣花亚纲茜草目忍冬科荚蒾族，灌木或小乔木，落叶或常绿，常被簇状毛，茎干有皮孔。冬芽袒露或有鳞片。单叶，单叶，对生，稀3枚轮生，全缘或有锯齿或牙齿，偶然掌状豆剖，有柄；托叶通常小，或不存在[^[1]]。

全球荚蒾属植物大约有200种，大多分布在气候较为湿润炎热或温暖的温带和亚热带地区，因此亚洲和南美洲有较多的分布。在中国有74种荚蒾属植物[^[2]]，散布广泛，散布在全国各省、自治区。

荚蒾属多数植物是优良的观赏植物，其中许多仍然在野外，未被开发使用。荚蒾属植物还是中药，它的根、茎、叶和成熟的果实均可药用，有清热解毒、除湿除虫、健体抗衰老的功能，部分已被用于新药草的临床应用。它对儿童的饮食和保健、儿童的成长发育、老年疾病的预防和治疗、妇科疾病、咳嗽和咳痰等有很好的治疗效果。

本实验所用样品根据形态学区分，有以下几种：

表1.1 形态学区分样品荚蒾属种类

图1.1 川西荚蒾 图1.2 蝴蝶戏珠花 图1.3 蝶花荚蒾 图1.4 金佛山荚蒾

图1.5 荚蒾茎横切图

1.2 DNA条形码技术

1.2.1 DNA条形码技术简介

DNA条形码（DNA barcode）是一种能够代表物种的DNA片段，它的特点是标准、具有足够的变化性、容易放大而且相对较短[^[3]]。DNA条码技术越来越多地用于那些不能肉眼或是其他方法辨别不出的生物信息的物种的检测。DNA条码技术分为以下几个阶段：对线粒体细胞色素c氧化酶(COI)基因的某一个短的片段进行测序；从分类未知的标本中提取DNA条码；并与DNA条码库进行比较[^[4]]。

DNA条形码技术的优点非常明显而且具有其独特性:

一、检测对象是DNA片段的序列，DNA序列不会因为个体生长不同和发育过程发育结果不同而发生任何改变。在不同生长阶段的同一物种的不同部位的DNA序列的信息是相同的[^[5]]，也就是说，通过人工的其他的处理，DNA序列的信息不随物质的形态结构变化而改变。与传统的方法相比较，可供检测的样本范围从原来的固定部位变成了整个植株上的任意部位；同时即便待检测的样本部分受损也不会影响检测鉴定的DNA序列信息的成果。

1. 可进行非专家物种鉴定。DNA条形码技术是具有一定的机械重复性，即只要设计完成实验方案，经过简单培训即可操作，人为误差的可能性小，偶然性小。
2. DNA条形码技术的准确性非常高。特定的物种有自己DNA序列，可以避免根据形态学鉴定特征出现的错误和不准确性。

1.2.2 DNA条形码技术研究现状

中药材目前的质量和鉴定评估方法主要依赖于药典中详细的形态学和分析植物化学方法。然而，中药材产品往往经过大量的原料加工，即使这些分析方法对特定的铅或标记化合物的质量控制是准确的，但这些方法对生物成分认证的适用性是有限的。近些年中医走向现代化的过程，使得药材原种、同义等问题更为突出，一般的鉴定方法如性状鉴定、显微鉴定和理化鉴定，它们对操作者的专业水平要求非常高，对鉴定经验依赖性较强，易受操作者主观因素的影响[^[6]]，这些方法都有各自的局限性。为了保证中药材的安全性和临床应用的准确有效，在中药材上鉴别中需要增加DNA条码分子鉴定方法。如今，应用像DNA分子条形码技术这样的分子生物学技术在中药领域的识别已经普遍存在。中国药典2015年版收载了中药材DNA条形码分子鉴定法指导原则[^[7]]，这表明，中国药材的分子鉴定是在实验室研究的基础上应用于国家标准的。

近年来我国学者对川贝母[^[8]]、黔太子参[^[9]]、甘草[^[10]]、防己[^[11]]和苍术[^[12]]的COI条形码序列进行了分析研究，结果均表明，基于该序列的DNA条形码技术可有效将其物种鉴定出来，为其市场监管提供了新的技术和手段。

1.3 研究的内容与目标

内容：使用试剂盒法得到荚蒾属各个物种的DNA，并在同样条件下对其进行PCR扩增，获得其ITS2序列，对序列进行评价和分析，构建部分荚蒾属药用植物DNA条形码鉴定体系。

目标：通过本次提取，解决如何从荚蒾属中药材DNA提取的问题实际问题。提高ITS2序列扩增效率，建立初步的荚蒾属药用植物的ITS2的鉴定体系，从分子水平鉴定不同基原的种间种内变异情况。

1.4 研究的目的与意义

DNA条码技术的出现将在生命科学、医学、食品质量控制等领域极大地提高监测能力，具有广阔的应用前景[^[13]]。DNA条码技术不仅会进一步发展传统分类学研究,也加速了保存和鉴定微生物资源,促进更高效的利用微生物资源[^[14]]。通过建立DNA条码数据库，可以快速识别大量样本。因此使用DNA条形码技术来鉴别中药材。然而，各种不恰当的方法都有可能降低DNA的质量和提取成功的几率，因此掌握恰当的方法等等是鉴别正确与否的关键[^[15]]。

我国荚蒾大部分都可以入药，最早的临床应用载于唐朝。其根、茎、叶和成熟的果实都可入药，具备清热解毒、祛风除湿、健脾消食、驱虫、强身、抗衰老等效果。功效主治：通经活络、活血消肿、祛风杀虫川[^[16]]。

DNA条形码技术具有较强的识别能力，在识别没有信息的中药样本、方法的普遍性和数字化方面具有独特的好处，在未来肯定会有更大的用处[^[17]]。光谱识别具有指纹识别的特点，在中药材和中药饮片的质量管理和物质鉴定方面具有很大的实用性。新的显微鉴别技术，色谱鉴别，通过PCR鉴定的特异性引物，生物效应，DNA芯片和仿生技术识别将在特定的中国传统医药的识别发挥了重要作用[^[18]]。

DNA条形码是近年提出的一种新的用于分子鉴定的新技术,其有利于发现新的物种和保护生物多样性,可以应用于监察严控濒临灭绝的珍惜动物的进出口贸易,可一应用于实现实现有害生物及外来物种的监察和严控,对我国生物资源保护具有非同寻常的意义[^[19]]。

本文应用DNA条形码技术对荚蒾属植物进行鉴定研究，目的是能简便、准确地鉴定荚蒾属植物，保障药材安全有效的使用。

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第2章 荚蒾属植物的DNA条形码鉴定研究实验方法

2.1 实验原理

荚蒾属植物的DNA条形码鉴定研究实验技术步骤示意图如下。

图2.1 DNA条形码技术步骤示意图

2.1.1 DNA提取原理

DNA提取是使选定的样品的细胞裂解，从中提取其基因组的全部DNA分子。细胞裂解方式一般采用化学方法，部分植物细胞裂解困难，可用生物酶进行辅助。本实验提取荚蒾属药用植物的基因组DNA分子，采用物理方式球磨仪和化学方式SDS相结合使荚蒾属样品的细胞裂解。DNA提取原理一般分为两种：

CTAB（十六烷基三甲基溴化铵），具有从低离子强度溶液中沉淀核酸与酸性多聚糖的特性。在高离子强度的溶液中（gt;0.7mol/L NaCl），其可溶解细胞膜，并与核酸形成复合物，该复合物可溶，不能沉淀核酸。通过有机溶剂抽提，去除蛋白、多糖、酚类等杂质后加入乙醇沉淀即可分离核酸。

SDS（十二烷基硫酸钠），先高温下使细胞裂解，使蛋白质变性；后提高溶液的浓度并降低温度，使蛋白多糖酚类等杂质沉淀，并通过离心除去；留取上清液，并用异戊醇再次提取残留杂质，加入异丙醇使核酸沉淀[^[20]]。

提取植物基因组DNA的方法很多，常用的是DNA提取试剂盒(Tiangen Biotech Co. ,China)法。DNA提取试剂盒是根据氯化芐法构建的，能够从样本中提取基因组DNA的试剂盒。将DNA试剂盒法应用于多种中药材植物的DNA提取，均可取得成果，结果表明该试剂盒适用于提取中药材的基因组DNA[^[21]]。由于中药材的复杂成分，可能不是每个部分都适合作为样品用于提取DNA，于是可以对不同部位的DNA提取的方法、工具、引物等试剂进行改进。根据根、花、果、籽、皮等药材，确定适当的样本量。花叶类药材取样量约30mg，果实、种子药材约40mg。

2.1.2 PCR原理

PCR由模板DNA变性--模板DNA引物退火--引物延伸三个基本反应步骤构成[^[22]]：

模板DNA的变性：粗提取后的DNA是复杂的双链结构，经过PCR的扩增分离，加热到94℃时，使其变性成为单链模式，为下一轮的退火反应做好准备；

模板DNA与引物的退火（复性）：样品DNA分子经加热变性后从双链变为成单链，温度由94℃降到56℃左右，此时合适的条件使得单链DNA与引物来时碱基互补配对结合；

引物的延伸：单链DNA模板与引物碱基互补配对生成结合物后，此时在DNA聚合酶的作用下，结合物以dNTP为反应原料，靶序列为模板，按碱基配对与半保留复制原理，合成新的单链。

2.1.3 测序原理

Sanger双脱氧链终止法（Chain Termination Method）：合成的寡核苷酸引物同单链DNA模版退火，设立4种不同的测序反应，每一种反应中都含有DNA聚合酶和4种正常的dNTP及少量的由3’-H取代了普通脱氧核糖3’-OH的2’,3’-ddNTP。如果ddNTP掺入到延伸的DNA链中，由于缺少进一步形成5’-3’磷酸二脂键的3’-羟基，DNA链的进一步延伸被终止。由于脱氧核苷酸的比例大于双脱氧核苷酸，DNA合成反应可以继续进行，并最终产生大量的不同片段长度的寡聚核苷酸。将4种反应产生的寡核苷酸加到测序相邻的泳道上，就可以从凝胶的底部到顶部按5’-3’方向读出新合成链的序列。

2.2 试验样品与来源

本次荚蒾属药用植物DNA提取实验，样品均通过野外采集、市场购买等方式获取样品，经过湖北中医药大学胡志刚副教授鉴定，样品保存在武汉理工大学化学化工与生命科学学院中药资源与分子鉴定实验室。详见表2.1。

表2.1 样品信息表

2.3 试剂及仪器

表2.2 试剂信息表