摘 要

全球环境的恶化、能源紧缺的情形变得更加严重。生物质能源作为一种可再生的清洁能源，成为了当前的研究热点之一。芒草生物质能源是一种极具开发潜力的能源，但芒草木质纤维素的组成及构造较为复杂，使其难被降解，导致利用率较低。本文主要研究了芒草半纤维素的酸降解和酶降解工艺，确定了最佳的降解工艺条件，并对降解液各组分的高效液相色谱分离条件进行了探索。

研究结果表明：芒草半纤维素酸降解的最佳条件为0.5 mol/L的硫酸溶液、料液比1:50、100 °C下反应2小时，在此条件下的降解率为90.97%；酶降解的最佳条件为2.0 g/L的半纤维素酶溶液、料液比1:60、55 °C下反应12小时，在此条件下的降解率为64.49%。高效液相色谱分析结果显示，乙腈、乙酸乙酯和水三组分混合流动相对降解液各组分具有较好的分离效果。初步测定降解液中含有木糖。

关键词：芒草；半纤维素；降解；组分分析

Abstract

The situations of global environmental deterioration and energy shortage have become more serious. As a renewable and clean energy source, biomass energy has become one of the current research hotspots. Miscanthus biomass energy is an energy source with great development potential. However, the composition and structure of lignocellulose in Miscanthus are more complex, making it difficult to be degraded. Thus resulting in low utilization rate. In this thesis, the acid degradation and enzymatic degradation process of Miscanthus hemicellulose was studied, the optimum degradation conditions were determined, and the HPLC separation conditions of each component of the degradation products were explored.

The results showed that the best condition for degradation of hemicellulose in Miscanthus was 0.5 mol/L sulfuric acid solution, and the solid-liquid ratio was 1:50, then reacting at 100 °C in 2 hours. The degradation rate under this condition was 90.97%. The optimum conditions for degradation were 2.0 g/L hemicellulose enzyme solution and the solid-liquid ratio was 1:60, then reacting at 55 °C in 12 hours. The degradation rate under this condition was 64.49%. The results of HPLC analysis showed that acetonitrile, ethyl acetate and water as the mobile phase can well separate the components of the degradation products. Xylose was preliminary determined in the degradation products.

Key Words: Miscanthus; hemicellulose; degradation; component analysis

目 录

第1章 绪论 1

1.1 研究背景 1

1.1.1 生物质能源 1

1.1.2 芒草简介 2

1.1.3 植物半纤维素及其利用现状 3

1.2 芒草半纤维素的研究进展 3

1.3 研究目的及意义 4

1.4 研究内容 5

第2章 芒草半纤维素酸降解工艺研究 6

2.1 实验仪器及试剂 6

2.1.1 实验仪器 6

2.1.2 实验试剂 6

2.2 实验方法 7

2.2.1 芒草半纤维素的提取 7

2.2.2 芒草半纤维素的酸降解 7

2.2.3 总还原糖含量的测定 7

2.2.4 芒草半纤维素酸降解的工艺优化 8

2.3 结果与讨论 9

2.3.1 芒草半纤维素酸降解的工艺优化（单因素实验） 9

2.3.2 芒草半纤维素酸降解的工艺优化（正交实验） 13

2.4 芒草半纤维素酸降解途径 14

2.5 小结 15

第3章 芒草半纤维素酶降解工艺研究 16

3.1 实验仪器及试剂 16

3.1.1 实验仪器 16

3.1.2 实验试剂 16

3.2 实验方法 16

3.2.1 芒草半纤维素的酶降解 16

3.2.2 芒草半纤维素酶降解的工艺优化 17

3.3 结果与讨论 18

3.3.1 芒草半纤维素酶降解的工艺优化（单因素实验） 18

3.3.2 芒草半纤维素酶降解的工艺优化（正交实验） 21

3.4 小结 23

第4章 芒草半纤维素降解液的高效液相色谱分析 24

4.1 实验仪器及试剂 24

4.1.1 实验仪器 24

4.1.2 实验试剂 24

4.2 实验方法 24

4.2.1 芒草半纤维素降解液各组分的高效液相色谱分离条件研究 24

4.2.2 芒草半纤维素降解液的高效液相色谱测定 25

4.3 结果与讨论 25

4.3.1 芒草半纤维素降解液各组分的高效液相色谱分离条件研究 25

4.3.2 芒草半纤维素降解液的高效液相色谱测定 28

4.4 小结 30

第5章 结论与展望 31

5.1 结论 31

5.2 展望 31

参考文献 33

致 谢 35

第1章 绪论

科技的不断进步和发展，使得人类能够在地球上不同的环境中更好地生存下来，由此带来了人口数量的急剧增长。随着人口数量的不断攀升，人类对资源的需求越来越多、对环境的破坏越来越严重。当今社会，资源短缺和环境污染已是阻碍社会发展最关键的问题之一。能源资源可以提供给我们各种所需要的能量，人类的生存和发展几乎完全依靠对各种能量的发现和利用。人类自身生命的延续、人类社会的发展、科技的进步等各方面，都离不开各种能源所提供的能量。在评价一种能源时，品质和产量都是最重要的。由于传统化石能源在地球中的储量少，以现在的使用速度，已探明的储量只能维持百年，且传统化石能源成分复杂，对其不合理的开采和使用造成了严重的环境破坏和资源浪费。因此，人们亟需开发和利用能够再生的清洁能源，以保证人类的永续发展。目前所能利用的清洁能源的来源主要有：太阳光、水电、风力发电等，而生物质能源是能够不断再生的一种清洁能源，可以同时解决人类在能源和环境方面所面临的问题，是目前人类所能利用的最好的能源。

1.1 研究背景

1.1.1 生物质能源

生物质广泛存在于地球上的各个地方，它包括动物、植物、微生物等生物本身以及它们自身的代谢产物。现代科技已可将生物质通过各种途径转化为燃料，进而替代传统化石能源，有效减轻环境污染^[1]。

生物质能源相对于传统化石能源，具有诸多优势：

（1）清洁环保可再生：植物在生长过程中，通过自身的代谢，获取空气和土壤中的物质，再利用太阳光，转化为生物质。因此，生物质燃料在合理使用过程中不会产生大量污染物^[2]。植物的固碳和燃烧过程形成了一个碳循环，可有效降低温室效应。植物的不断繁殖是其不断再生的基础。

（2）总量丰富易获取：地球表面多数地方适合生物生存，因此生物质广泛分布于地球上各个地方，尤其是气候适宜的地方，生物质密度很高，能为人类提供大量的生物质资源。

生物质中的能量来自于绿色植物的光合作用。光合作用将太阳光中的能量转化为化合物中的化学能，贮存于生物质中。绿色环保可再生、储量丰富易获得的优势使得生物质能源成为一种重要的替代能源^[3]。因此，大力开发利用生物质能源，能够同时解决能源的缺乏，改善环境污染严重的现状。目前来看，人们所主要利用的生物质还是对人类极为重要的农作物粮食^[4]。可以提供生物质能源的原料主要包括传统农作物的秸秆、农产品废弃物和能源植物等，但随着人们对生物质能源需求的进一步增长，生物质能源的原料正由农作物粮食、农业废弃生物质，向主动生产根据需求开发的含新型生物质的植物转变^[5]，这使得发展优质能源植物资源成为生物质能源研究领域的热点。

1.1.2 芒草简介

芒草包含一个很大的植物家庭，有着15至20种芒属植物^[6]，它们统称为芒草，包括中国芒、五节芒、荻和南荻等。芒属植物为禾本目禾本科植物，它们现已广泛分布于世界上温带和热带的各个地区。在我国，芒草在寒冷的东北地区和西藏等高海拔地区都有分布。

芒草最初作为一种普通的野草，只是被用来造纸，随着对能源植物的研究不断发展，芒草作为能源植物的各种优势开始显现出来^[7]：

（1）环境适应能力强：无论是低纬度的热带地区，还是高纬度的寒温带地区，都有芒草的分布。在山地、丘陵、草地、湿地等各种环境中，都分布有芒草。由于其高效的光合作用效率，这些不同环境中分布的芒草都能有很高的生物质产量。

（2）改善环境能力强：芒草具有耐重金属、耐盐碱、耐干旱等适应极端环境的能力，因此通过引进种植芒草可以改善当地的环境。芒草在燃烧时的碳排放与其生长时吸收的二氧化碳量几乎相当，可以认为是碳的相对零排放。同时芒草燃烧热值高，灰烬少，对环境几乎没有污染。

（3）生物质产量高：芒草的光合作用途径为C₄途径，属于C₄光合型植物，这种光合作用效率高于C₃光合型植物，可高效固碳来积累生物质，其生物质产量在各种能源植物的生物质产量中处于较高水平。

（4）生物质品质高：植物的木质纤维素，主要包含纤维素、半纤维素和木质素这三大主要成分，其中木质素的含量决定了植物降解利用的难易程度，木质素含量越低 木质纤维素越易被降解。芒草中木质素含量很低，远低于稻秆、小麦秆、玉米秆等植物的木质素含量，易被降解生产生物质燃料。

从1980年开始，欧美等国家就把芒草作为能源植物来进行研究^[8]。丹麦在1983年建立起了第一个芒草试验基地。1984年，美国的草本能源作物研究计划正式开始，经过多年的实验研究表明，芒草是更适合发展的生物质能源^[9]。在我国，芒草很早就被用来造纸，但开始研究作为生物质能源植物的芒草的时间相对较晚，主要的研究方向包括品种选育、基因改造、栽培试验等，并取得了一定的成果。随着各国对发展能源植物芒草的愈加重视，研究者们分别开展了对芒草的选育、栽培、基因测序和遗传多样性分析等研究。目前在芒草的利用方面主要有：直接燃烧发电、生产燃料乙醇、生产沼气、生产饲料、造纸、药用、改善大气污染和土壤环境污染等。芒草以其具有的生物质产量高、品质优和灰分低、热值高、环境适应能力强等诸多优点被认为是目前最具开发潜力的生物质能源植物之一，很有可能成为最具利用价值的新型优质生物质能源植物。

1.1.3 植物半纤维素及其利用现状

半纤维素伴生于纤维素间，可溶于10%的碱溶液而不溶于水。作为植物细胞壁中第二大组分的半纤维素，其含量仅低于纤维素，产量丰富，但不同于纤维素单纯的聚葡萄糖组成结构，半纤维素是一种低分子量的杂聚糖化合物，它是一类物质的总称^[10]。组成半纤维素的碳水化合物分为两类，一类是五碳碳水化合物聚合物，即聚戊糖（(C₅H₁₀O₅)_n），主要由木糖、阿拉伯糖的缩聚组成，是半纤维素的最主要组成成分；另一种是六碳碳水化合物聚合物，又称聚己糖（(C₆H₁₂O₆)_n），主要由包括甘露糖、葡萄糖等糖缩聚而成。除了组成半纤维素的单糖种类多样外，在不同植物中，甚至同一植物的不同生长期中，半纤维素的组成结构也有所不同。半纤维素的分子量比纤维素的分子量小很多，聚合度在一百左右^[11]。半纤维素的化学性质较纤维素来说不稳定，可以被无机酸水解。然而，由于半纤维素聚合物分子的分支度较高，分子结构分散且不定型，在目前的技术条件下半纤维素的降解程度低，使得含量仅次于纤维素的半纤维素未能被充分利用，导致了资源浪费。

在过去的多年里，能源问题愈加突出，半纤维素在地球上储量巨大却很少有人问津，可以说半纤维素是一种物美价廉的优质能源。半纤维素有着巨大的应用潜力和极高的市场价值，它可以被直接利用，或通过改性来间接应用在造纸工业、食品工业、医药工业、化学工业等各个领域。目前半纤维素主要应用于：

（1）造纸工业：半纤维素对纸张的性能有着一定的影响；

（2）食品工业：半纤维素水解可得到大量的木糖，由于木糖对人体具有很好的保健作用，可以应用于保健食品中；

（3）医药工业：半纤维素可用于药物的片剂分解剂、胆固醇抑制剂和其他医药用途的制剂；

（4）化学工业：半纤维素降解能得到大量的糖类，通过微生物发酵可生产燃料乙醇，从而替代传统化石能源，降低污染，还可以用于生产丁二醇、有机酸、糠醛等工业产品。

1.2 芒草半纤维素的研究进展

芒草中的生物质能主要源于其含有大量的木质素、纤维素和半纤维素。由于在植物长期的自然进化过程中，木质纤维素的构造及组成较为复杂化，形成了一道难以被外界条件改变的天然屏障，需要经过复杂的预处理、酸或酶催化水解等过程才能将其转变为单糖或其他物质，从而被下游产业利用^[12]，这极大地增加了芒草生物质能源的利用成本。面对这一科研难题，国际上的研究方向，主要在于通过研发新型转化技术、利用生物技术来调控生物质的积累两个方面来改善这一情况。近年来，科研工作者在改变芒草木质纤维素中的生物质组成、结构等方面取得了重要成果，并对培养产量高、能够高效转化的新型品种芒草方面高度重视，并获得了一定的成果，但在芒草的生物质转化技术的改进方面关注较少。

在植物半纤维素转化生产燃料乙醇的过程中，有必要对其进行一定的降解来将其转化为小分子物质^[13]，然后再将其发酵成乙醇。在诸多的降解方法中，各种酸性物质是最有效且最廉价的降解催化剂^[14]。美国的相关科研工作者一直致力于研究酸催化水解半纤维素，并取得了很好的效果。“稀酸解-酶解发酵工艺”已成为由半纤维素生产燃料乙醇中较为成熟的工艺之一^[15]。酸水解半纤维素效率很高，几乎可以完全降解半纤维素^[16]，从而用于发酵生产燃料乙醇。在酸降解半纤维素中，影响半纤维素酸水解的因素很多，主要包括酸种类、酸浓度、料液比、反应时间、反应温度、原料粒径等^[17]。在过去的研究中，酸降解半纤维素的反应条件多为高温高压^[18]，近来，常温常压水解半纤维素的研究受到了广泛关注^[19]。由于酶催化反应具有诸如条件温和、催化效率高等优势，在利用酶来催化降解半纤维素的这一方面，越来越受到人们的重视^[20]。酶催化降解半纤维素在工业上的应用，具有使反应更加安全、减少反应物对设备的腐蚀等优势^[21]。对于酶催化降解半纤维素的研究已经开展多年，主要研究酶法降解半纤维素生产保健食品低聚木糖等^[22]，人们对生产低聚木糖所需原料的特性及预处理方法、不同微生物来源的半纤维素酶的相关特性以及酶解过程的工艺条件及产物控制等方面都进行了广泛研究^[23]，取得了一定的成果。但目前在酶催化降解半纤维素方面仍存在着很多问题，且针对酶降解工艺的系统研究较少，同时存在如酶产量低、酶活度不高、酶不易与底物接触等问题^[24]。同样，对于酶催化降解的半纤维素，主要从粮食作物等的秸秆和农业废弃物中提取得到，但对于来源不同的富含半纤维素的植物原料缺乏研究，特别是对于新型能源植物芒草中的半纤维素研究较少。

1.3 研究目的及意义

能源缺少和环境污染的情况日益严重，芒草作为优质能源植物脱颖而出。半纤维素作为木质纤维素中第二大含量的成分，未得到有效利用。目前在植物半纤维素的酸降解研究领域，工艺已经较为成熟。由于不同植物半纤维素的含量、构造及单糖的组成成分都不一定相同，而研究较多的植物却是甘蔗、玉米、小麦等粮食作物，作为新型能源植物的芒草，人们对其半纤维素的降解研究较少。因此，对芒草半纤维素降解及其降解液成分分析的研究具有重要意义。同时研究芒草半纤维素的酶解工艺，对于提高芒草利用价值，对芒草资源的更进一步利用等方面，具有重要意义。

因此，本论文通过研究芒草半纤维素酸降解和酶降解工艺，确定最佳的降解条件，并利用高效液相色谱法，测定降解液的成分，可以为提高芒草利用价值，并对芒草半纤维素降解的进一步应用提供一些参考。

1.4 研究内容

本论文通过提取芒草半纤维素，对其进行硫酸降解和半纤维素酶降解，讨论降解反应中各步骤主要的影响因素，通过单因素实验和正交实验来确定各因素的影响程度，并确定最佳的降解工艺条件，同时采用高效液相色谱法分析了降解液的成分。

主要研究内容：

（1）芒草半纤维素酸降解工艺研究；

（2）芒草半纤维素酶降解工艺研究；

（3）芒草半纤维素降解液的高效液相色谱分析。

第2章 芒草半纤维素酸降解工艺研究

2.1 实验仪器及试剂

2.1.1 实验仪器

表2.1 实验仪器

2.1.2 实验试剂

表2.2 实验试剂

2.2 实验方法

2.2.1 芒草半纤维素的提取

将实验室获取的芒草秸秆置于高速万能粉碎机中制成粉末状，过筛。称取3 g芒草粉末，转移至250 mL锥形瓶内，加入10%（质量分数）的NaOH溶液（料液比为1:10），用玻璃棒搅拌，使其充分混合，再放于超声波清洗机中，辅助提取30分钟。60 °C恒温下保温3.5小时，冷却至室温，抽滤，洗涤滤液至pH为5 ~ 6，减压蒸馏到原体积的三分之一。取上述方法得到的溶液，加入3倍体积的95%的乙醇，室温沉降24小时，再于离心机中以5000 r/min转速离心15分钟，抽滤，滤渣用70%的酸化乙醇洗涤3次。最后真空干燥72小时，可以得到较为纯净的半纤维素颗粒。

2.2.2 芒草半纤维素的酸降解

将提取得到的半纤维素颗粒置于玛瑙研钵中，研成细粉末状，称取0.1 g半纤维素于10 mL离心试管中，加入一定料液比、一定浓度的硫酸溶液，超声辅助分散20分钟，再放入一定温度的烘箱中恒温一定时间，取出冷却，抽滤，用1 mol/L的氢氧化钠溶液调节滤液pH至中性，转移至100 mL容量瓶中，定容，取1 mL酸解液于25 mL比色管中，DNS法测总还原糖含量。

2.2.3 总还原糖含量的测定

（1）显色剂的配制：取2.76 g苯酚，加入到6.08 mL 10%（质量分数）的NaOH溶液中，搅拌使其溶解，再加入蒸馏水稀释至27.6 mL，然后加入2.76 g亚硫酸钠，即为溶液1；取102 g酒石酸钾钠，加入到120 mL 10%（质量分数）的NaOH溶液中，再加入352 mL 1%的3,5-二硝基水杨酸溶液中，即为溶液2。最后将溶液1、2混合，震荡均匀，置于棕色的试剂瓶中放置7天。

（2）标准曲线的绘制：准确称取0.100 g葡萄糖，置于50 mL的烧杯中，用去离子水搅拌溶解，再转移至100 mL容量瓶中，去离子水定容。用1 mL移液管分别移取0.0、0.2、0.4、0.6、0.8、1.0 mL 1 mg/mL的葡萄糖标准溶液于6个25 mL比色管中，加去离子水2.0 mL，再加入1.5 mL的DNS试剂，震荡均匀，置于沸水浴中，充分反应5分钟后，冷却至室温，去离子水定容。取一定量的上述溶液于1 cm的石英比色皿中，在紫外可见分光光度计550 nm的波长下，平行测定吸光度，绘制标准曲线。以糖浓度为横坐标，吸光度为纵坐标，绘制糖标线，如图2.1所示，得到线性回归方程为：A = 0.6229c - 0.0064 (R² = 0.9991)。