摘 要

产纤维素降解酶的微生物在纤维素资源的再生转化、提高农产品废渣利用率、堆肥的使用以及治理环境污染等方面具有很高的应用价值。而分离选育高效纤维素降解菌显然是这一切的基础与前提。

本研究利用CMC培养基对实验室保存的高温纤维素降解菌进行活化培养，并用LB培养基进行扩大培养，然后对收集的2kg菜叶用高温菌进行固体发酵制作腐熟剂，再用腐熟剂对从马房山菜市场收集的10kg农产品废渣进行一次堆肥，验证腐熟剂的效果。堆肥结束后可以看见农产品废渣明显地被降解了。最后测得菌液、腐熟剂、第二次堆肥后的样品的酶活分别为70.22U/mL、250.89U/mL、160.11U/mL。

实验结果表明：包含大量高温菌的腐熟剂具有很好的分解纤维素效果，这对于实际绿色处理农产品废渣具有重大意义。

关键词：纤维素降解菌；酶活；堆肥；腐熟剂

Abstract

Microorganisms, producing cellulose degrading enzyme, have high value in many aspects such as the regeneration and transformation of cellulose resources, the improvement of utilization ratio of agricultural waste residue, the use of compost, and the treatment of environmental pollution. The separation and breeding of highly efficient cellulose-degrading bacteria is clearly the basis and prerequisite for this content.

In this study, the high-temperature cellulose-degrading bacteria kept in the laboratory were activated and cultured in CMC culture medium, and expanded and cultured in LB medium. Then, the collected 2kg vegetable leaves were used for the first time to produce composting agent for small compost, and then used. The composting agent performed a large-scale composting on the 10kg agricultural product residue collected from the Mafangshan vegetable market to verify the effect of the decoction agent. After the composting, it can be seen that the agricultural residue is significantly degraded. Finally, the enzymatic activities of the broth, compost, and the second compost were 7.22 U/mL, 25.89 U/mL, and 16.11 U/mL, respectively.

The experimental results show that the decomposing agent containing a large number of high-temperature bacteria has a good effect of decomposing cellulose, which is of great significance for the actual green treatment of agricultural product waste residue.

Key Words： Cellulose degrading bacteria; Enzyme activity; Compost; Composting agent

目 录

第1章 绪论 1

1.1 农产品废渣和纤维素酶概述 1

1.1.1 农产品废渣 1

1.1.2 纤维素和纤维素酶 1

1.1.3 有机腐熟剂中纤维素酶标准 2

1.2 高效纤维素降解菌概述 2

1.3 农产品废渣处理的现状 2

1.3.1 农产品废渣对生态环境质量的影响 2

1.3.2 农产品废渣的主要利用途径 3

1.4 高温堆肥的分类 4

1.5 高温堆肥研究现状 4

1.5.1 国外堆肥化的研究进展 5

1.5.2 国内堆肥化的研究进展 5

1.6 课题研究目的及意义 6

1.7 课题研究内容及技术路线 6

1.7.1 研究内容 6

1.7.2 研究技术路线 6

本课题的研究技术路线如图1.1所示。 6

第2章 产纤维素酶高温菌株的分离和优化 8

2.1 实验材料和方法 8

2.1.1 高温菌菌株来源 8

2.1.2 实验仪器 8

2.1.3 化学实验试剂 8

2.1.4 实验所用分析方法 8

2.1.5 葡萄糖标准曲线的绘制 8

2.2 高温菌菌株培养与分离 10

2.2.1 培养基成分 10

2.2.2 培养与分离方法 10

2.2.3 高温菌单菌落的保存 11

2.2.4 结果与分析 11

2.3 高温菌菌株的产酶活性 11

2.3.1 培养基成分 11

2.3.2 实验方法和步骤 11

2.3.3 结果与分析 12

2.3.4 高温菌产酶条件 13

第3章 腐熟剂的制备 14

3.1 液体扩大培养 14

3.2 固体发酵 14

3.3 结果与分析 14

3.3.1 固体发酵中的温度变化 14

3.3.2 固体发酵始末含水率 15

3.3.3 固体发酵始末pH值 16

3.3.4 纤维素酶活的测定 16

3.3 结论 16

第4章 农产品废渣高温堆肥 17

4.1 污泥高温堆肥步骤 17

4.2 测定指标与方法 17

4.3 结果与分析 17

4.3.1 堆肥过程中的温度变化 17

4.3.2 固体发酵始末含水率 18

4.3.3 固体发酵始末pH值 18

4.3.4 纤维素酶活的测定 18

4.4 结论 18

第5章 结果讨论 20

5.1 高温菌评价 20

5.2 腐熟剂评价 20

致谢 21

参考文献 22

第1章 绪论

农业领域里发展的最大问题就是环境问题，农业发展过程中会产生一些废水及废渣等,这些都会给环境造成污染，只有将这些废水、废渣处理好，才不会污染环境^[1]。中国是一个把农业作为主要生产模式的国家，农产品废渣的种类特别多、数量又超级大^[2]。农产品废渣指的是在农业生产活动中产生的各种废弃物，并且大多农产品经过浸提等加工工艺处理后含水量高，存在转移不方便等多方面问题，长期堆放不当的话会造成环境污染问题。因此，如何高效、经济、科学地处理农产品废渣已经成为绿色农业领域的热门研究课题。

1.1 农产品废渣和纤维素酶概述

1.1.1 农产品废渣

农产品废渣，即农业废弃物，指的是在农业生产活动中产生的各种有机废弃物，一般我们所提及的农产品废渣大体指的是农作物秸秆和禽畜粪便^[3]。每一年在农业领域皆会生产出超级多的废弃物质，然而这其中的很大一部分都没有能够得到比较有效的循环再利用。

1.1.2 纤维素和纤维素酶

植物内部都含有大量的纤维素，农作物自然不例外。在地球上含量最多并且分布最为广泛的一种多糖类物质就是我们的纤维素了。纤维素中的碳的总含量占据所有植物总碳量的比例竟然能够超过了一半，毫无疑问它是地球上种类和数量都庞多的一种可以再次被循环利用的资源^[4]。纤维素写成化学分子式为(C₆H₁₀O₅)n，它是某一种大分子的多糖类物质，其分子量竟然可以达到五万至两百五十万，这可是相当于三百至一万五个葡萄糖基^[5]。据不完全统计，全球因为燃烧农产品废渣每年产生的经济损失可以达到上几十亿元，由此可以见得我们对于纤维素的利用率是多么的低^[6]。

纤维素酶是酶类的其中一种，在分解纤维素时起到的是生物催化的作用^[7]。纤维素是一种内部结构相当不简单的物质，不管是哪种酶皆难以独自高效地去把它水解掉，所以能够使得纤维素降解的微生物往往需要一次性产生好几种的酶，然后它们会一起组成一个十分庞杂的酶体系来进行协同作用使得植物细胞壁物质降解掉。所以，纤维素酶其实是降解纤维素产生葡萄糖的一个系列的酶的合称，它们相互间起着协同作用，而绝对不仅仅是独自一个的酶。纤维素酶在地球上的各种各样的生物内部随处可见。在真菌、细菌和动物身体内部均能够顺利发现纤维素酶。然而产生纤维素酶的那些细菌比较容易就会失去了产酶的能力，一旦失去了产酶的能力的话就会引起产出纤维素酶的能力大幅度降低的不好情况。纤维素酶的出处以及品种也是非常的繁多。纤维素酶的构造和用途因为来源的不相同而存在着极大的差异。

1.1.3 有机腐熟剂中纤维素酶标准

目前在我国实行的有机物料腐熟剂标准是由我国农业部门公布实行的《中华人民共和国农业行业标准》（NY609-2002），这个标准对于有机物料腐熟剂中的纤维素酶活标准有着相当详细的规定：液体、粉末和颗粒物的纤维素酶活全都要大于或者是等于30.0U/mL^[8]。

1.2 高效纤维素降解菌概述

高效纤维素降解菌，简称高温菌，研究发现它可以在超过45℃的温度下成长和繁衍，它往往被人们发现于火山口以及其附近区域，还有工业区排放出来的高温废水等，它的种类包括一些细菌、真菌以及古菌^[9]。

高温菌按照生活环境的温度差异可以划分为以下三类：

兼性高温菌：它最高的生长温度可以到达40～50℃之间，但是最适宜的生长温度仍然处于中等温度，所以我们把它又叫做耐热菌^[10]。

专性高温菌：它最合适的生长温度超过了40℃，在此温度下就会生长得特别的差，甚至有的时候都不能够生长起来^[10]。

极端高温菌：它最适宜的生长温度超过了65℃，而且它并不能够在40℃以下的温度成长^[10]。

1.3 农产品废渣处理的现状

1.3.1 农产品废渣对生态环境质量的影响

以前，我国农村通常把农产品废渣作为有机肥料直接还田以达到处理的目的，这大大提高了培肥地力和物质能量循环，然而目前农民们已经慢慢转换了传统的生产用肥和生活用能方式，这就使得农产品废渣相对过剩问题愈来愈突出，严重污染着生态环境。农产品废渣的不断堆积会占据掉无数的农用耕地，农民们一般采取焚烧的方式来解决这个问题，但是焚烧的话不可避免地会让土壤表面5cm处温度达到65℃～90℃，这就会极大地阻碍土地里微生物的生长，并且隔断物质循环在农田生态系统中发生，以及对供应和转化在农作物养分中的发生产生相当不良的影响，这就会造成数不清的有机质散失掉，极大损坏土壤的构造，削弱其肥力。

其次，无数氮氧化合物、SO₂、碳氢化合物以及烟雾尘埃等物质会在农产品废渣燃烧过程中伴随着产生，经过太阳光照发生反应就会产生一些有害物质，这又进一步造成了再污染，形成了滚滚的烟雾，大幅度降低了空气的清新程度，把我们的生存环境大程度地损坏了。而没有被回收和处理的农产品废渣就被随意地抛弃在路边和村头巷尾，长时间得不到有效合理的处置，以至于都腐败变质了，散发出极其恶臭的气味勾引来蚊蝇，四处传播病菌，并且把我们的生活环境都大力污染了。

1.3.2 农产品废渣的主要利用途径

最近这十几年来，国内外科学家对于农产品废渣的合理有效资源利用的研究与技术得到了比较大的进步成果，农产品废渣的资源化利用途径日益呈现出一种多样化的趋势。从总体来看，农产品废渣的资源化利用方式一般集中在饲料化、能源化及肥料化等几个方向^[11]。

大量的纤维类物质和蛋白质存在于农产品废渣中，经过技术人员恰当的处理一下就可以作为禽畜的饲料来使用，这包括了动物废渣的饲料化以及还有植物纤维废渣的饲料化。植物纤维废渣一般指的是农产品秸秆类物质，含有少量营养物质，进行一个机械和生化复合处理过程，就能把动物难以高效吸收利用的秸秆类物质进行深层次改进，增强其营养价值和适口性。动物废渣的饲料化一般指的是禽畜的粪便以及各类加工后余下的下脚料的饲料化过程，未消化的粗蛋白、粗纤维以及矿物质等物质皆包含于其中，施以发酵、热喷、干燥等的加工方法处理后跟饲料进行混合后便可以可以饲喂动物。但是，动植物废渣的饲料化技术现如今发展还并不成熟，仍然有太多的技术问题存在着，所以现如今这并非农产品废渣资源利用的热门发展方向。

在农产品废渣能源化利用方面，现如今我国一般将农产品废渣进行生物发酵产生沼气，这对于我国生态环境的良性循环、缓解农村能源紧张的状况具有极大的促进作用，而且具有产量大、环境友好、再生周期短等诸多优点，只不过存在技术落后、农产品废渣低利用率等缺点。

农产品废渣进行肥料化利用的方式有这样两种：直接以及间接利用。把秸秆或者是粪便直接施用于田间就是直接利用方式，容易操作、方便运作是这项技术的大大的优点。相关科学研究证明，农产品废渣直接返还到田地后跟土壤中的各种微生物进行缓慢作用而被分解，产生的矿物质养分给植物进行吸收利用，而且产生的腐殖质和有机质还能够作为土壤中的微生物和其他一些生物的伙食，改土培肥、增加农作物产量的作用在某种程度上就此体现出来了。然而降解速率较缓慢以及整个过程中有可能会损坏农作物的根部是其显著的缺点，进而会对农作物的成长产生一些不好的影响。农产品废渣通过堆肥的方式进行还田就是间接利用方式，这能有效增强土壤肥力，然而堆肥堆放腐解时间较长、占据场地较大等是其弊端，这就会使得农产品废渣总量持续上升跟环境承受载力持续降低的矛盾日益显现。在科学技术水平的持续增强下，技术人员创新地把传统的堆肥技术手段跟工业化设备相结合起来，并施以催腐剂和酵素菌等的生物制剂加快反应。机械化、专业化和规模化是现如今农产品废渣肥料化的热门发展方向，产量高、肥效高、周期短、污染小、便迁运等方面是产业化开发利用农产品废渣生产有机化肥产品的优势。

由此可见，通过现代工艺设备结合高温堆肥来处理农产品废渣具有极大优势及发展前途。

1.4 高温堆肥的分类

高温堆肥的分类方法有许多种，最常用的分类方式是按照微生物的成长环境划分为好氧堆肥以及厌氧堆肥这两种^[12]。

有氧状态下，好氧微生物对农产品废渣进行降解的过程就称作好氧堆肥过程。二氧化碳、水分、热量和腐殖质是好氧堆肥的最终主要产物。好氧堆肥一般用于城市生活垃圾的处理，堆肥堆体的温度一般为50～65℃，最高甚至能够超过70℃，堆肥的周期较短，可以连续性操作，因此也把它称为高温快速堆肥。好氧堆肥由于得到的肥料品质一般都不错，所以往往被用来生产有机肥料。不过，需要对堆肥的原料进行相当仔细的挑选以及必须进行通风和搅拌是好氧堆肥的明显缺点，这就对于我们的设备品质要求较高，能源消耗较大，资金投入也就会比较大。

在无氧状态下，厌氧微生物降解农产品废渣的过程就称作厌氧堆肥过程。二氧化碳、甲烷、热量和腐殖质是厌氧堆肥的最终主要产物。厌氧堆肥的时候，不让堆体接触到空气，堆体温度偏低，整个工艺相对较简陋，成本不是很高，适应各种原材料，氮素在成品肥中能找到不少，不过其工艺条件的不太简单把控，成功完成一次堆肥的周期比较长，降解有机物的速率非常缓慢。低降解效率、容易散发臭味、原料不完全被分解、低产品品质、肥效不高都是它的明显不足之处。事实上，堆肥的好氧状态和厌氧状态是辩证的，原因是在好氧堆肥的时候，原料比较大块而且分布不均匀，于是肯定存在着厌氧堆肥过程；与此相反，因为密封不够密实，厌氧堆肥的时候也往往会有好氧菌在发生着生物化学作用。

1.5 高温堆肥研究现状

高温堆肥技术是欧美发达国家在20世纪初所开发研究成功的，目前在美国、英国、日本、德国等国家高温堆肥技术已经被大范围用于无害化处理农产品废渣，譬如在美国大约有49％的农产品废渣每年在农田或林地制成肥料^[13]。

近些年来环保方面的科研人员愈来愈重视农产品废渣高温堆肥方面的科学研究，并且它已经慢慢成为农产品废渣资源化的比较热门的研究方向，国内外大量的科研人员在这一方面的科学研究已经得到了一些相当不错的结果。

1.5.1 国外堆肥化的研究进展

近几十年来，关于农产品废渣高温堆肥的研究非常热门，美国Mckinle等^[14]对在农产品废渣堆肥中起作用的有关微生物情况进行了仔细研究。G.shea等^[14]钻研了在堆肥过程中施用的调理剂的特点和使用细节。Finstein等^[14]对农产品废渣高温堆肥的时候温度的变化、堆体微生物的活性和通风的把控及其监察进行了大量的科学实验研究。他们推论出，温度、湿度、pH值、C/N等许许多多的条件都可以对农产品废渣的高温堆肥进程以及最终堆肥产物的品质带来极其严重的影响。在这众多影响条件中，堆肥的时候最必不可少的主要条件是温度，堆体一般要经过升降温和持续高温这三个过程。70年代初，西方率先开发了Beltsvin^[14]好氧高温堆肥法，它具有操作非常简单、运行费用极低、堆肥周期比较短的优点。这个厉害的方法从堆体底部打出多个孔用多根管道导进空气，有效阻止了堆体的臭气弥漫，相当的环保卫生。Kubota等^[14]系统地对高温堆肥技术进行仔细研究并且率先推出了关于堆体腐熟度的判断准则。Finstein等^[14]通过大量的科学研究证明，堆肥的时候堆体内部的温度明显高过表面的温度，因此适时对堆体进行翻堆是非常必要的。堆体翻堆能够使堆体内部的微生物与氧气充分接触进行好痒堆肥，加快干燥速率，改善堆体的通气性，减少臭味，并且显著提高有机物讲解速率和堆肥速率。

1.5.2 国内堆肥化的研究进展