摘 要

黄孢原毛平革菌产生的胞外酶由木素过氧化酶、锰过氧化酶、己二醛氧化酶和漆酶等组成。由于这些酶性质的独特性，能降解很多类型的有机污染物。目前来说，黄孢原毛平革菌的应用越来越广泛，例如对工业废水的脱色处理，对有机毒物的降解及将煤、石油进行生物转化和生物加工等方面。

本研究主要是通过在黄孢原毛平革菌的培养液中添加一定量的纳米二氧化硅，检测其酶活、生物量、对染液的脱色率等一些参数。该研究表明，纳米二氧化硅终浓度为0.5g/100mL的复合体的酶活最大且电泳显示的酶量最多，因此选择该浓度进行后续实验。检测该浓度下复合体的生物量、流体特性等参数。结果表明复合体的生物量先迅速增加后达到稳定；黏度在培养过程中不断增加；在形态上，有纳米二氧化硅的复合体的菌丝比无纳米二氧化硅的黄孢原毛平革菌更窄且更饱满。对结晶紫染料的脱色中，纳米二氧化硅终浓度为0.1g/100mL的复合体的脱色率最大。

关键词：黄孢原毛平革菌；纳米二氧化硅；锰过氧化物酶

Abstract

The extracellular enzymes produced by Phanerochaete chrysosporium were composed of lignin peroxidase, manganese peroxidase, adipaldehyde oxidase and paint enzymes and so on. Because of the uniqueness of these wines, many types of organic pollutants can be degraded. At present , it is more and more widely used, such as decolorization of industrial wastewater, and organic the degradation of poisons and the transformation of coal and petroleum into biological processes and biological processes.

In this study, a certain amount of Nano-silica was added to the broth of Phanerochaete chrysosporium to detect its enzyme activity, biomass, and decolorization rate of the dye liquor. The study showed the enzyme activity was the largest and the amount of enzyme showed by electrophoresis was the highest, when the final concentration of Nano-SiO2 was 0.5g/100 mL.Therefore, this concentration was selected for subsequent experiments. The parameters such as biomass and fluid properties of the complexes at this concentration were examined. The results showed that the biomass of the complex first increased rapidly and reached stability; the viscosity increased continuously during the cultivation process; in morphology, the mycelium of the Nano-silica complex was narrower and more saturated than that of the Phanerochaete chrysosporium without Nano-silica. For the decolorization of crystal violet dyes, the decolorization rate of the composite with a final concentration of 0.1 g/100 mL of Nano-silica is the highest.

Key Words：Phanerochaete chrysosporium; Nano-silicon; Manganese peroxidase

目 录

摘 要 I

Abstract II

目 录 III

第1章 绪论 1

1.1白腐真菌及其研究现状 1

1.2黄孢原毛平革菌及其研究现状 1

1.2.1木素过氧化物酶（LiP） 3

1.2.2锰过氧化物酶（MnP） 3

1.3纳米二氧化硅 5

1.3.1干法制备纳米二氧化硅 5

1.3.2湿法制备纳米二氧化硅 6

第2章实验材料和过程 8

2.1 实验材料 8

2.1.1实验试剂 8

2.1.2 实验仪器 9

2.1.3 其他实验器材 9

2.2 实验过程 9

2.2.1 培养基及试剂配制 9

2.2.2实验步骤 12

第3章 结果与讨论 18

3.1 实验结果 18

3.1.1黄孢原毛平革菌在平板上的形态 18

3.1.2液体培养的菌丝球 18

3.1.3加入不同浓度的纳米二氧化硅的复合体酶活性 19

3.1.4蛋白质电泳 20

3.1.5生物量的结果分析 21

3.1.6终浓度为0.5g/100mL酶活的结果分析 22

3.1.7构建动力学模型 22

3.1.8发酵液流体特性 23

3.1.9结晶紫脱色 24

3.1.10 扫描电镜 25

3.2讨论 26

第4章 总结与展望 27

参考文献 28

致 谢 32

第1章 绪论

1.1白腐真菌及其研究现状

白腐真菌属于丝状真菌，腐生在木材上，能穿过木质，进入木质细胞内，通过降解酶的作用，使木质白色腐烂成海绵状团块。白腐真菌的种类多种多样，包括侧耳菌属、栓菌属、香菇属等，最常见的有黄孢原毛平革菌、云芝、平菇、侧耳菌等，其中关于黄孢原毛平革菌的研究最为广泛。白腐真菌最重要的特点是其对木质素的强烈的降解能力，是已知的对木质素的降解能力最强的木腐真菌，能在木质腐烂过程中破坏多糖和木质素，甚至可将木质的主要组分完全降解，产生CO₂和H₂O。白腐真菌对木质素强烈的降解能力使得其在生物技术领域备受关注。大量的研究表明白腐真菌在生长过程中产生多种胞外酶，使其具有独特的降解机制，对降解污染物具体非专一性、光谱性、彻底性及适于固液两种基质等特点，对异生物质同样具有强烈的降解能力^{[1]-[2][3][4]}。

自从20世纪80年代被首次报道以来，白腐真菌便引起了学术界的广泛关注，国内外对其生物学特性、环境污染物处理及酶学等方面进行广泛而热烈的研究，经过多年的努力，目前对白腐真菌的应用进步很大。未来对于白腐真菌的研究多集中于培养条件的完善和优化、生物学领域研究、发掘更光谱的化学物质降解能力及与其他微生物的综合利用等这几个方面^{[5]-[2][3][4][5][6]}。

1.2黄孢原毛平革菌及其研究现状

黄孢原毛平革菌（Phanerochaete chrysosporium）是一类具有较强有机物降解能力和环境友好的丝状白腐真菌，是目前已知的白腐真菌中研究最为广泛的一种。黄孢原毛平革菌具有很强的木质素降解能力。木质素是是地球上仅次于纤维素的第二大可再生有机物，木质素是一类结构复杂、不定型的、具有三维空间结构的芳香族化合物，很难被一般的微生物通过水解作用降解，并且对多种微生物的降解作用具有抗性。黄孢原毛平革菌对木质素强烈的降解源自于它在次级代谢过程中产生多种胞外酶，包括过氧化物酶、乙二醛氧化酶、漆酶。其中过氧化物酶和乙二醛氧化酶是黄孢原毛平革菌的木质素降解体系中的关键作用酶（过氧化物酶包括木素过氧化物酶Lip和锰过氧化物酶MnP）。在降解木质素的过程中，Lip和MnP依赖于H₂O₂启动催化作用，而乙二醛氧化酶能提供H₂O₂^{[7]-[8][9] [10][11]}。

黄孢原毛平革菌降解木质素有三个特点^[12]：第一，能完全降解木质素生成CO₂，而细菌最多将20%的木质素转化成CO₂；第二，降解过程主要是氧化反应，产物中不会出现木质素单体；第三，降解过程需要从外界获取碳源和能源降解木质素。

在培养过程中，木素过氧化物酶是降解木质素的关键酶系中的重要酶，且含量比锰过氧化物酶含量高，对木质素的降解能力比锰过氧化物强。但是锰过氧化物酶与木素过氧化物酶同样是木素降解体系中的关键酶。

黄孢原毛平革菌产生的过氧化物酶对木质素的降解过程中，以下几个因素对木质素的降解起到了一定的作用：

（1）氮源

大量研究表明，木质素的降解释可分为两个阶段完成，第一阶段是降解木质素的酶系的合成，在这个过程中不发生木质素的降解；第二阶段是降解木质素酶系的合成，在这个过程中木质素开始被降解，降解过程是在培养基中氮源消耗完后才开始^[13]。大量的研究发现，若是培养基中的氮浓度过高，会抑制木质素降解酶的活性，但并不会影响黄孢原毛平革菌的菌体生长。其原因主要有^[14](1)培养基中氮源充足时，加速了木质素降解过程中其它所必需能源的消耗；（2）在降解过程中，C源的代谢和木质素的降解共同竞争所必需的生长因子；(3)在降解过程中，N源能控制多种木质素降解中的物质合成；(4)由于氮源充足，菌体的生长增加，使得菌体的呼吸作用加快。Feen.Choi和Kirk^[15]通过实验发现，氯化铵、组氨酸、谷氨酸和谷氨酰胺是木质素降解酶中最有效的氮源。

（2）碳源

有研究表明，黄孢原毛平革菌所产酶系在降解木质素的过程中，当培养基中的碳源消耗结束后，木质素的降解也随之停止。当培养基中没有入葡萄糖、纤维素等碳源时，黄孢原毛平革菌对木质素的降解反应不会启动；也有研究表明，高浓度的葡萄糖会抑制过氧化物酶对木质素的降解，而低浓度的葡萄糖会促进酶对木质素的降解^[16]。

（3）pH

对于黄孢原毛平革菌，降解木质素的最佳pH为4.0-4.5。当溶液的pH大于5.5或者小于3.5时，降解木质素的反应会受到抑制，而菌体生长的最适pH比降解木质素过程中的pH要高^[13]。曾有人报道当溶液的pH从最适值到3.5-5.5的变化时，黄孢原毛平革菌降解木质素而产生的二氧化碳急剧下降。因此，pH对黄孢原毛平革菌产过氧化氢酶有着重要的影响，所以在溶液中加入缓冲液控制pH是极其重要的。

1.2.1木素过氧化物酶（LiP）

木素过氧化物酶是黄孢原毛平革菌木素降解体系中重要的一种酶，LiP 可以利用过氧化氢或者有机过氧化物催化氧化一系列底物，Kirk^[17]等人在限氮培养黄孢原毛平革菌时发现了十种过氧化物同工酶。在这些同工酶中，H1，H2，H6，H7，H8和H10是木素过氧化物酶，其中H2和H8的数量占优，它们是按在高效液相色谱分离柱中洗脱顺序命名的。LiP的同工酶在结构上的同源性,还反映在他们的动力学性质、对所有同工酶而言,他们的Vmax/Km（对H₂O₂）基本相等。木素过氧化物酶的催化作用具有非特异性，因此它可以作用的底物很广泛，包括酚类和非酚类芳香化合物，可氧化木质素单体、二体、三体以及多环芳烃如苯并芘等底物。木素过氧化物酶的催化作用实际上是一种自由基化学，实质为酶的氧化中间体使敏感的芳核反应发生单电子氧化，形成一种底物芳基阳离子自由基，这种自由基再发生各种非酶促反应,产生各种终产物。木素过氧化物酶所催化的反应主要有节醇的氧化、碳碳键断裂(包括侧链断裂和开环)、氧化性脱基、经基化、脱甲基、脱甲氧基和酚二聚化或聚合^[18]。

木素过氧化物酶的酶活测定：1.5mL 0.1mol/L酒石酸铵缓冲液（pH3.0），1.0mL 10mM藜芦醇，0.4mL粗酶液混合在ep管中，混匀后以0.1mL 10mM H₂O₂溶液启动反应的进行，测该反应体系在310nm处3min内的动力学曲线，其中参比溶液中用蒸馏水代替H2O2溶液。一个酶活力单位(U)定义为每分钟氧化黎芦醇产生1μmol黎芦醛所需的酶量^[19]。

1.2.2锰过氧化物酶（MnP）

锰依赖过氧化物酶是一种含血红素辅基的酶，它的底物是有机酸，可以氧化Mn² 为Mn³ ，而Mn³ 可以与a-羧基酸鳌合，形成高氧化还原势的鳌合物，催化氧化二级底物如酚化合物、木质素相关复合物和许多其它物质。锰过氧化物酶由一系列的糖基化的同工酶组成，它们的差别在于等电点不同。在限氮条件下,黄孢原毛平革菌至少分泌四种同工酶，每种同工酶都含一分子原叶琳辅基。黄孢原毛平革菌的分子质量为40-47kDa^[49],等电点为4.2-4.5。MnP的催化反应速度与锰螯合剂的存在有关，需要H₂O₂的启动。另外，MnP对高浓度的H₂O₂敏感，易被氧化为无活性的氧化态复合物Ⅲ。

如图1.1所示，MnP的催化作用循环始于锰过氧化物酶中的Fe³ 与H₂O₂或有机过氧化物结合形成铁过氧化物联合体，同时亚铁血红素上的2个电子转移到过氧化物的双氧键上，使其断裂释放出1分子H₂O，并形成复合物Ⅰ。接着由1个鳌合的Mn² 作为电子供体将复合物工还原为复合物II，同时自身被氧化为Mn³ ，随后复合物II再被1个鳌合的Mn² 还原回原型完成该循环，放出2分子H₂O₂^{[20]-[21][22][23][24][25]}。