摘 要

生物膜作微生物适应环境的生存方式，使微生物对环境中的不利因素具有更高的耐受性。自然环境中的生物膜系统，大部分是由多种而非单种微生物一起组成的。在本研究中，测定了Y49和Y6两种细菌分别在游离和生物膜状态下，对于3种抗生素（氨苄青霉素、链霉素、卡那霉素）和8种重金属（氯化银、氯化汞、硫酸镉、铬酸钾、硫酸铜、氯化镍、硫酸锌、氯化钴）的最小抑制浓度（Minimum inhibitory concentration，MIC），比较了两种状态下MIC的变化；探索了两种菌在单独以及不同比例混合培养时和加入重金属离子后两种细菌形成生物膜量的变化。结果显示，两种细菌在游离状态下，对抗生素抗性具有相反的表现，作为革兰氏阳性菌的Y49对氨苄青霉素敏感，对链霉素和卡那霉素有抗性，而作为革兰氏阴性菌的Y6对氨苄青霉素有抗性，对链霉素和卡那霉素敏感。Y49表现了比Y6更高的应对Cr（VI）的MIC，但二者对其它7种重金属的MIC基本一致。当细菌形成生物膜后，对应的MIC要大于处于游离状态下的MIC；Y49比Y6形成更多的生物膜量，并且在混合培养中，Y49越多，形成生物膜量越多。加入重金属离子（Cd和Cr）后，低浓度的Cd刺激了更多生物膜量的形成。总体而言，细菌在形成生物膜后，它的抗生素抗性和重金属抗性会有不同程度的提高；Y49与Y6的成膜能力差异可能与细胞壁的组成及胞外多聚物（Extracellular polymeric substance，EPS）的分泌有关。值得注意的是，重金属离子Cd对生物膜形成的刺激作用为首次发现，其内在相关机制有待于更深入的研究。

关键词：细菌；生物膜；抗生素抗性；重金属抗性

Abstract

As a way of adapting to environments, biofilms make microorganisms have better resistance to adverse factors in the environments. In this study, the minimum inhibitory concentration (MIC) of three antibiotics and eight heavy metals under the free and biofilm form of Y49 and Y6 have been determined, and the changes of MIC under two conditions have been compared. The amount of biofilm between two bacterial strains have been also explored when cultured separately and mixed in different proportions, and the heavy metals were added. The results showed that under the free forms，two bacteria had different performances in antibiotics resistance. Gram-positive Y49 was sensitive to Amp, but resistant to Str and Kana, and Gram-negative Y6 was on the contrary. The results also showed that the MIC was greater in the form of biofilm than those in the form of free forms. The amount of biofilm formed by Y49 was greater than Y6, and in the mixture of both strains, the more Y49 was added, the more biofilm were obtained. Between the two bacteria, Y49 had stronger capacity in biofilm forming than Y6. The low concentrations of added Cd stimulated the formation of biofilm. Generally, both bacteria in the form of biofilm might have improved resistance to antibiotic and heavy metals. The difference of Y49 and Y6 in biofilm formation might be concerned with the structure of cell wall and the secretion of extracellular polymeric substance (EPS). Noticeably, the stimulation of extremely toxic Cd but not moderately toxic Cr for biofilm formation was firstly reported, in which the involved mechanism was waiting for further investigation.

Keywords: bacteria; metal resistance; antibiotic resistance; biofilm

目录

第一章 绪论 1

1.1 生物膜 1

1.2自然界中的生物膜 3

1.2.1 自然界中的生物膜 3

1.2.2 生物膜中生态学 3

1.3生物膜抗生素抗性 5

1.3.1 胞外聚合物屏障作用 6

1.3.2特殊的微环境 7

1.3.3生物膜表型改变 7

1.3.4细菌的群体感应系统 7

1.3.5激活应激反应 8

1.3.6 其它机制 8

1.4生物膜重金属抗性 8

1.4.1胞外聚合物（EPS） 8

1.4.2膜外排泵 9

第二章 材料与方法 11

2.1仪器与试剂 11

2.1.1仪器 11

2.1.2其它用具 11

2.1.3试剂规格与厂家 12

2.1.4培养基及试剂的制备 12

2.2实验方法 13

2.2.1游离细胞抗生素MIC测定 13

2.2.2生物膜细胞抗生素MIC测定 13

2.2.3游离细胞重金属MIC测定 13

2.2.4生物膜细胞抗重金属MIC测定 14

2.2.5生物膜培养 14

2.2.6 分析方法 14

第三章 结果与分析 15

3.1游离细胞抗生素MIC 15

3.2生物膜细胞抗生素MIC 15

3.3游离细胞重金属MIC 16

3.4 生物膜细胞重金属MIC 16

3.5 生物膜培养 17

3.5.1不同组合细胞培养形成生物膜量 17

3.5.2重金属对生物膜形成影响 18

第四章 讨论 20

第五章 结论与展望 21

5.1结论 21

5.2展望 21

参考文献 22

致 谢 24

第一章 绪论

1.1 生物膜

生物膜是指微生物附着在某些物体表面，自身分泌一些蛋白质、多糖等生物大分子物质，形成胞外聚合物（extracellular polymeric substance，EPS），这些胞外聚合物将微生物粘结并包绕起来形成的微生物聚集体。它是微生物为了适应生存环境而出现的一种生存方式，与游离细胞相对应。在自然环境中，绝大多数的微生物都以生物膜的方式存在，而并不是游离细胞^[1]。在合适的条件下，任何微生物都可以形成生物膜^[2]。

生物膜形成是个动态的过程。以细菌为例，游离细胞首先与附着物表面接触，黏附上去，然后等待下一步在物体表面形成生物膜，这时的细胞并未形成生物膜，细菌还是可以游离出来，所以这个过程是可逆的；然后，附着在物体表面的细菌与生物膜形成的有关基因表达，分泌出胞外聚合物，将细胞粘结包绕起来，也让细胞和物体表面的黏附更加紧密牢固，这个过程不可逆。在上述不可逆的黏附过程之后，就是生物膜的成熟过程，细菌与胞外分泌物形成蘑菇状或柱状的亚单位，多个单位形成具有三维立体结构的成熟生物膜。最后，成熟的生物被膜又可以将膜内的细菌释放出来，成为游离细胞，重复上述的生物膜形成过程，形成新的生物膜。

图1 细菌生物膜形成过程示意图^[3]

随着科学研究对于生物膜的形成及其机制的深入，越来越多的生物膜用于修复治理污染的环境。在治理环境污染问题时，除了物理化学方法，还常常有生物方法，而很多时候，生物方法回避物理化学方法更加得方便经济有效。在污水治理中，就常常用生物膜法来吸附除去废水中的重金属和有机物^[4]，而其中使用的生物膜反应器如果采取合适的运行方式，还可以具有反硝化脱氮的功能。除此之外，自然水体的生物膜还可以作为检测河流重金属污染的指示物^[5]。

在生物膜的形成过程中，微生物从单个的游离细胞到黏连包绕在一起的微生物聚合体，是有一个调控的过程的，而这个过程的承担者主要是细菌间的群体感应（Quorum sensing，QS）^[6]系统以及细菌的环境信号应答系统。当环境中有不利因素时，不利因素会刺激细菌，从而激活细菌的环境信号应答系统，这时细菌内与生物膜有关的调控元件的转录或者表达会发生变化，对胞外物质的合成产生一定的影响，导致细菌的表面结构产生变化，是细菌能够在物体表面发生黏附。当有一定数量的细菌在物体表面黏附时，会激诱导细菌的菌体感应系统，细菌产生一种叫做自诱导物（Auto-inducer，AI）的信号分子，是细菌群体感应中的重要媒介。而它在不同细菌之间，种类有所不同，在革兰氏阳性菌间的，是寡肽类（Autoinducing peptides，AIP）、在革兰氏阴性菌间的，是酰基高丝氨酸内酯类（N-acylhomoserine lactones，AHL或AI-1），当同时存在于革兰氏阳性和阴性菌间时，是4，5-二羟基-2，3-戊二酮（4,5-Dihydroxy-2,3- pentanedione，DPD 或AI-2）衍生物等类型的自诱导物 ^[7] 。而除此之外，胞外DNA也是这个过程所需要的^[8]。当细菌相环境中释放的信号分子浓度增加，达到一定的阈值时，会进入细胞质，与其应答元件相结合，致使细菌内相应的蛋白质转录表达改变，细菌大量在物体表面黏附，并黏连聚集在一起，从而形成生物膜细胞^[9-10]。

1.2自然界中的生物膜

1.2.1 自然界中的生物膜

在实验室中，我们构造生物膜体系常常会用某单个菌株来做，给予它一定的生长环境。但是当细菌处于自然环境中时，它所形成的生物膜系统往往是由多种不同菌构成，而环境中存在的许多生物与非生物因素又会对形成的生物膜产生各种影响。在自然环境中，最常见的生物膜系统就是自然水体生物膜，它存在于河流，湖泊，池塘甚至是水沟中。而在这种条件下形成的生物膜系统，是处在动态的变化之中的，水体环境中的成分会进入到生物膜中，进行一系列的转化，而后又会随着生物膜的脱落，再次进入到水体中。它与在实验室中构建的静态生物膜体系有着很大的区别。在自然水体环境中，影响生物膜系统因素有许多，水体中存在的化学物质，水体所处地区温度、光照，水体温度以及水体流速等都会对生物膜系统形成产生显著影响。

1.2.2 生物膜中生态学

在自然环境中的生物膜系统，大部分都是含有几种或多种微生物的，他们之间会发生信息传递，彼此相互作用，形成一个动态稳定的系统。自然环境中生物膜中的主要相互作用类型是竞争和合作。而作用类型的主要判断依据就是形成的生物膜量。对于作用类型，有一种较为精确的定义方式：当有多物种生物膜形成的生物膜量高于每个单菌株形成的生物膜量时，认为是协同效应；而当多物种生物膜形成的生物膜量低于形成生物膜量最少的菌株时，则判断菌株间是拮抗作用^[11]。