摘 要

表面活性剂在各领域被广泛使用。生物表面活性剂作为由细菌发酵代谢产生的具有无毒性，可降解性，与原料的亲和性，在高温、高压、高盐等极端环境 中保持良好的乳化活性的优点，使其在石油泄露后的生物修复、微生物提高原油采收率（MEOR）和输送方面的应用前景广阔，在食品、保健品、化妆品和农业方面的应用具有代替化学表活剂的潜力。

本论文从油污土壤中分离获得一株可产生生物表活剂的细菌，经16S rDNA鉴定为枯草芽孢杆菌，命名为BL-27，将该菌株在以蔗糖和木糖作为碳源的无机盐培养基中发酵代谢，通过表面张力的测定预测该菌株产生物表活剂。并根据OD₆₀₀、pH的变化、表面张力的下降和发酵液上清的乳化指数EI₂₄的测定得到：菌株BL-27在45℃，转速200rpm的摇床发酵培养条件下，不同碳源下菌株产生的表面活性剂具有相同的变化趋势。且在发酵12h后表面张力显著降低，及产生表面活性剂，而表面活性剂发酵的最佳发酵周期为60h。

BL-27菌株72h后产生的发酵液上清对柴油的乳化性能实验数据表明：蔗糖培养基所产生的表面活性剂浓度高于木糖培养基所产生的表面活性剂。而两者产生的表活剂在不同pH、温度及盐度的条件下表现出相同的变化趋势；其中，菌株产生的表活剂在pHgt;8.0的碱性条件下表现出了良好的乳化活性，而酸性条件会破坏表活剂的作用。且在10-90℃下均发酵液上清均表现出良好的乳化活性。而盐度对表活剂的反应有显著的抑制作用，盐浓度大于20g/L后乳化活性下降显著。

关键词：枯草芽孢杆菌 生物表面活性剂 16S rDNA 乳化指数EI₂₄ 表面张力

Biosurfactant Produced by Hydrocarbon-Degrading Bacteria BL-27 and Its Emulsifying Properties for Diesel Oil

ABSTRACT

Surfactants are widely used in various fields. As a non-toxic, degradable and compatible material produced by bacterial fermentation and metabolism, biosurfactant has the advantages of maintaining good emulsifying activity in extreme environments such as high temperature, high pressure and high salinity. It has broad application prospects in bioremediation after oil leakage, microbial enhanced oil recovery (MEOR) and transportation, and in food, health products and chemical industry. Cosmetics and agricultural applications have the potential to replace chemical surfactants.

In this paper, a bacterium producing surface active agent was isolated from oily soil and identified as Bacillus subtilis BL-27 by 16S rDNA. The bacterium was fermented and metabolized in inorganic salt medium with sucrose and xylose as carbon source. The surface tension was measured to predict the production of surface active agent. According to the change of OD600, pH, the decrease of surface tension and the determination of the emulsification index EI24 of the supernatant of fermentation broth, it was found that the surfactant produced by the strain BL-27 had the same trend under the conditions of shaking-bed fermentation at 45 C and 200 rpm. After 12 hours of fermentation, the surface tension decreased significantly and surfactant was produced. The optimum fermentation period of surfactant was 60 hours.

The emulsifying properties of the supernatant of fermentation broth produced by BL-27 strain 72 hours later on diesel oil showed that the concentration of surfactant produced by sucrose medium was higher than that produced by xylose medium. The surface activator produced by the two strains showed the same trend under different pH, temperature and salinity conditions. Among them, the surface activator produced by the strain showed good emulsifying activity under alkaline conditions with pH gt; 8.0, while acidic conditions would destroy the role of surface activator. The supernatant of fermentation broth showed good emulsifying activity at 10-90 ℃.

Salinity significantly inhibited the reaction of surfactant, and the emulsifying activity decreased significantly when the concentration of salt was more than 20 g/L.

Key words: Bacillus subtilis, Biosurfactant, 16S rDNA, Emulsification index, Surface tension

目录

摘要 II

ABSTRACT III

第一章 文献综述 1

1.1前言 1

1.2生物表面活性剂的研究现状 2

1.2.1生物表面活性剂 2

1.2.2生物表面活性剂的分类及来源 2

1.2.3生物表面活性剂的优势及应用 3

1.2.4生物表面活性剂的发酵生产 4

1.3本课题的研究目的与意义 5

第二章 材料与方法 6

2.1实验材料 6

2.1.1 目的菌株 6

2.1.2实验仪器 6

2.1.3实验试剂 6

2.2实验方法 7

2.2.1目的菌株的活化培养 7

2.2.2菌株BL-27鉴定 7

2.2.3 目的菌种的发酵培养 8

2.2.4 目的菌株生物量的测定 8

2.2.5发酵上清液表面张力的测定 9

2.2.6发酵上清液对柴油乳化性能的测定 9

第三章 实验结果与讨论 10

3.1 菌株16S rDNA的序列系统发育分析 10

3.2菌株的生物量测定 10

3.3发酵上清液的表面张力测定 13

3.4 发酵上清液对柴油乳化指数EI₂₄ 15

3.4.1 发酵上清液稀释后的乳化指数EI₂₄ 15

3.4.2 pH对柴油乳化稳定性的影响 15

3.4.3 温度对柴油乳化稳定性的影响 16

3.4.4盐度对柴油乳化稳定性的影响 17

第四章 结论与展望 19

参考文献 20

致谢 24

第一章 文献综述

1.1前言

石油是一国工业的血液，是燃油和化工品的直接来源，对于一国的工业经济发展起着举足轻重的作用[1-4]。据报道我国石油储量有60亿吨，在世界排名第八名，我国石油储量仅占世界总量的2.3%，可开采年限只有20.6年[5-6]。我国油田的采收率为 32.2%，美国油田的采收率为 33.3%，沙特油田的采收率为 38.4%[7-8] 。我国石油消费量为一年约5亿吨，其中70%依赖进口。中国石油储量少、采收率低与消费量大、对外依存度高的矛盾越来越成为我国一个需要重视的问题。提高我国的原油采收率则是一个较好的办法，如原油采收率每提高一个百分点， 则对应可多开采 出1.8 亿吨的原油，相当于目前一年的产油量。

当前油田的开采技术——以重质原油的开采为例分为三个阶段。首个阶段是利用地层的天然压力将原油压出地面进行开采，即一次采油，采收率为 5-10%[9-10]；在一次开采后，地层压力下降不足以将油压出，需要向地层注入水或气以提供开采原油所需的压力，这就是二次开采，原油采收率在此阶段可提高至 30-40%[11]。油田在经过经一次、二次采油后含水率可达 80%[12]，石油缺乏流动性，油田的渗透性也大不如前[13]，此时再重复利用上述两次采油的方法是很难将剩余的石油从油田中开采出来的，因此，三采技术的重要性得以体现。三采技术又称“提高石油采收率（EOR）“技术，它以油田中藏在岩石等不易开采地方的油为目标， 综合利用物理、化学试剂和微生物注入等技术来提高原油采出率[14-15]。三采技术目前形成了四大技术分支，具体包括化学法、气驱法、热力法和微生物采油法[16-17]。其中，MEOR及微生物提高原油采收率法进展较为突出，此法可将原油采收率在原油基础上提升 10%以上[18]，对环境造成的不利影响也较小；化学法是使用大量工业生产的化学物质如乳化剂表活剂等，效率高但也更加稳定在自然状态下难以降解，使用会对油田的开采环境造成破坏，同时也不易事后清理，环境成本较高。因此，生物方法产表面活性剂采油成为了人们更加偏好的方向。随着人们在三采技术上的投入与研究，生产出的表活剂质量越来越精良，现在的要求，不仅是要表活剂具有较低的水油界面张力，更在乎它生产的成本是否低廉，以及具体在油田的使用效果。因此，在研究过程中更加倾向使用既高产又廉价的发酵菌种与方式，使得生物表活剂具有市场竞争力。

1.2生物表面活性剂的研究现状

1.2.1生物表面活性剂

生物表面活性剂是一种无毒，可被生物降解的表面活性剂。其由微生物或植物代谢产生，代谢过程中可分泌出的具有一定表界面活性，集亲水基和疏水基结构的两亲化合物，如糖脂、多糖脂、脂肽或中性类脂衍生物等，因它对环境影响很小，具有高效的表面活性，是合成表活剂的理想代替品[19]。

1.2.2生物表面活性剂的分类及来源

生物表活剂通常是根据其化学组成，分子量，物理化学性质，作用方式以及来源分类。生物表活剂根据分子量可分为低分子量表活剂和高分子量乳化剂[18,20,21]。低分子量表活剂包括脂肽、糖脂和磷脂类化合物，分子量在 500-1500 之间[22]，主要作用是降低物质表面或界面张力。高分子量的生物乳化剂包括杂多糖、脂多糖、蛋白或脂蛋白或者这些物质的复合物[20,21,23]，它能够在低浓度下形成和稳定水包油（O/W）或油包水（W/O） 乳化层，但不能明显降低油物质的表面或界面张力[24,25]。