摘 要

四氢嘧啶巨大的应用价值和广泛的应用前景，引起广泛的关注。但其生产技术效率较低，限制了其的发展，所以本实验以E.coli为宿主，构建异源四氢嘧啶生产者，并通过发酵优化提高其产量和转化率。

（1）首先通过把Halomonas.Venusta的ectABC片段重组到E.coli MG1655里，构建异源四氢嘧啶生产者E.coli MG1655（pTrc-ectABC），并实现四氢嘧啶的异源表达，产量为1.08 g/L，转化率为0.021 g/g。

（2）其次针对初始产量、产率以及发酵过程pH较低等问题进行发酵优化。先降低发酵液初始葡萄糖浓度，得出最佳初始葡萄糖浓度，再采用不同的策略对pH进行调控，得出最佳发酵条件是在原有的培养基基础上，把初糖浓度降为5 g/L，KH₂PO₄含量降为2.5 g/L，添加7.5 g/L K₂HPO₄。而在此条件下所得的产量和转化率分别是6.23 g/L和0.12 g/g。

（3）最后通过Red重组技术，把工程菌株的pta基因进行敲除。所得的产量为5.02 g/L,转化率为0.08 g/g，产量产率均有所下降，故此策略效果不佳。

关键词：四氢嘧啶；异源表达；E.coli；发酵优化；Red同源重组

Construction and fermentation optimization of metabolic engineering bacteria producing ectoine

Abstract

The great application value and wide application prospect of ectoine have aroused wide attention. But its production technology efficiency is low, restricted its development. Therefore, this experiment takes E.coli as the host to construct a heterogenous producer of ectoine and improve its yield and conversion rate through fermentation optimization.

(1) First, the ectABC fragment of Halomonas.Venusta was recombinant into E. coli MG1655 to construct the E. coli MG1655 (pTrc-ectABC) of producer of ectoine, and the heterogenous expression of ectoine was achieved, with a yield of 1.08 g/L and a conversion rate of 0.021 g/g.

(2) Secondly, the initial yield, yield and low pH during fermentation were optimized. The optimal initial glucose concentration was obtained by first reducing the initial glucose concentration of the fermentation broth, and then adjusting the pH with different strategies. The optimal fermentation condition was obtained by reducing the initial glucose concentration to 5 g/L and KH₂PO₄ content to 2.5 g/L as well as adding 7.5 g/L K₂HPO₄ on the basis of the original culture medium, And under these conditions, the yield and conversion rates were 6.23 g /L and 0.12 g /g, respectively.

(3) Finally, the pta gene of the engineered strain was knocked out by Red recombination technology. The yield obtained was 5.02 g/L and the conversion rate was 0.08 g/g. The yield and yield all decreased, so the strategy was not effective.

Key words：Ectoine；Heterogenous expression；E.coli；Fermentation optimization；Red homology recombination

目录

摘要 I

Abstract II

第1章 前言 1

1.1 引言 1

1.2 四氢嘧啶性质及生物合成途径 1

1.2.1 四氢嘧啶性质 1

1.2.2 四氢嘧啶生物合成途径 2

1.3 四氢嘧啶的应用 2

1.3.1 在环境修复上的应用 2

1.3.2 在酶技术工程中的应用 3

1.3.3 在医药领域的应用 3

1.3.4 在化妆品中的应用 3

1.4 四氢嘧啶制备技术 4

1.4.1 分批发酵与流加发酵 4

1.4.2 细菌挤奶 4

1.4.3 静息细胞 4

1.5 本论文研究主要内容、目的意义 5

第2章 四氢嘧啶合成工程菌的构建 6

2.1 实验材料 6

2.1.1 菌株和质粒 6

2.1.2 试剂和仪器 6

2.1.3 培养基 6

2.2 实验方法 8

2.2.1 菌株的培养 8

2.2.2 菌株基因组的提取 9

2.2.3 DNA片段的PCR扩增 9

2.2.4 扩增DNA的纯化回收 9

2.2.5 质粒的提取 9

2.2.6 质粒的酶切及重组构建 10

2.2.7 菌株化学转化法感受态的制备和转化 10

2.2.8 SDS-PAGE电泳分析重组蛋白 10

2.2.9 液相色谱法检测发酵液四氢嘧啶的浓度 11

2.2.10 发酵液葡萄糖含量的测定 11

2.3 结果与讨论 11

2.3.1 重组质粒pTrc-ectABC的构建 11

2.3.2 四氢嘧啶合成途径的异源构建 13

2.3.2 发酵考察E.coli合成四氢嘧啶的能力 14

第3章 四氢嘧啶工程菌株的发酵优化 16

3.1 实验材料 16

3.1.1 菌株 16

3.1.2 试剂与仪器 16

3.1.3 培养基 16

3.2 实验方法 16

3.2.1 菌株的培养 16

3.2.2 液相色谱法检测发酵液四氢嘧啶的浓度 16

3.3 结果与讨论 17

3.3.1 初糖浓度对重组菌株合成四氢嘧啶的影响 17

3.3.2 控酸策略对重组菌株合成四氢嘧啶的影响 18

第4章 四氢嘧啶工程菌株乙酸支路的改造 22

4.1 实验材料 22

4.1.1 菌株和质粒 22

4.1.2 试剂与仪器 22

4.1.3 培养基 22

4.2 实验方法 22

4.2.1 菌株的培养 22

4.2.2 菌株电转化法感受态的制备和转化 22

4.3 结果与讨论 23

4.3.1 pta基因缺失的四氢嘧啶工程菌株的构建 23

4.3.2 发酵考察pta基因缺失菌株合成四氢嘧啶的能力 25

第5章 结果与展望 27

5.1 结果 27

5.2 展望 27

参考文献 29

致谢 31

第1章 前言

1.1 引言

四氢嘧啶是一种水溶两性的环状氨基酸衍生物，性质稳定，不易分解，可以作为细胞生长的能源物质、渗透压补偿溶质、细胞保护剂、蛋白稳定剂和化妆品添加剂等，在环境修复、酶技术工程、医学以及化妆品行业等方面具有巨大的应用价值和广泛的应用前景。目前生产四氢嘧啶所采用的生物技术，其分离纯化难度大，生产成本高而产量较低，大大制约了四氢嘧啶的应用与发展，而以重组E.coli来生产四氢嘧啶可以很大程度解决上述问题。因此本课题基于这个为出发点，着眼于产量问题，将以E.coli为宿主，构建异源四氢嘧啶生产者，以得到合成四氢嘧啶能力较强的菌株，并对具有合成四氢嘧啶能力较强的重组菌株进行发酵调控，及产酸途径改造，减少乙酸的产生及积累，提高碳源的利用率，以期提高产量和降低生产成本。

1.2 四氢嘧啶性质及生物合成途径

1.2.1 四氢嘧啶性质

四氢嘧啶（Ectoine）全称为1，4，5，6-四氢-2-甲基-4-嘧啶羧酸，分子式是C₆H₁₀N₂O₂，分子量为142.16 g / mol，分子式如图1-1，熔点为280 ℃，外观为白色粉末[1]。四氢嘧啶是一种水溶两性的环状氨基酸衍生物，溶于水、甲醇、乙醇、丙二醇、甘油等，但不溶于二甲基亚砜、三氯甲烷，是一种极性、不带电的小有机分子，性质稳定，不易分解，广泛存在与中度嗜盐菌中。

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