摘 要

自来水厂中的细菌群落可能对自来水处理工艺处理效果、出水水质等具有显著影响。传统的细菌分离培养技术对于环境样本中细菌群落的揭示具有较大的局限性，近年来，高通量测序技术的出现和发展使得对于细菌群落的揭示有了新的依托。本文采用高通量测序技术对自来水厂各流程中细菌群落特征进行了分析，结果表明，自来水厂中微生物主要隶属于12个门，其中变形菌门（）和放线菌门）普遍占主要优势。纵观整个水处理流程，变形菌门（）是呈先下降再升高的趋势，而放线菌门()丰度则呈先升高再下降的趋势，至消毒出水(A5)，放线菌门()丰度下降至11.720%，反应自来水水质有所提高。自来水中Sediminibacterium和unclassified_Chitinophagaceae这两种菌属的亲缘关系最近，但自来水中含量较少，其和水中优势菌属hgcI_clade、CL500-29_marine_group具有较远的亲缘关系，说明基因转移的单位比较广。

关键词：自来水厂；高通量测序；细菌群落结构

Study on Characteristics and Changes of Bacterial Community in Tap Water Treatment Process

Abstract

The bacterial community in the waterworks may have a significant impact on the treatment effect of the tap water treatment process and the quality of the effluent water. The traditional bacterial isolation and culture technology has great limitations on the revealing of bacterial communities in environmental samples. In recent years, the emergence and development of high-throughput sequencing technology has made new support for the revealing of bacterial communities. In this paper, high-throughput sequencing technology was used to analyze the bacterial community characteristics in various processes of the waterworks. The results showed that the microorganisms in the waterworks were mainly affiliated to 12 gates, of which Proteobacteria (Proteobacteria ) and Actinobacteria (Actinobacteria) generally occupied the main advantage. . Throughout the whole water treatment process, Proteobacteria (Proteobacteria) is the first to decline and then increase, while the abundance of Actinobacteria (Actinobacteria) is first increased and then decreased, to disinfection effluent (A5), release line The abundance of the bacteria (Actinobacteria) was reduced to 11.720%, and the water quality of the reaction tap water was improved. The two species of Sediminibacterium and unclassified_Chitinophagaceae in tap water have the closest relationship, but the content of tap water is less. It has a distant relationship with the dominant species hgcI_clade and CL500-29_marine_group in water, indicating that the gene transfer unit is relatively wide.

Keywords: Water plant、High-throughput sequencing、Bacterial community structure

目录

摘要 I

Abstract II

第一章 综述 1

1.1自来水厂处理工艺 1

1.2高通量测序技术 2

1.2.1 454测序技术 2

1.2.2 Solexa测序技术 2

1.2.3SOLID测序技术 3

1.3．高通量测序技术的应用 3

1.3.1 在海洋中的研究 3

1.3.2 在土壤中的研究 4

1.3.3在污水中的研究 4

1.3.4在人体上的研究 5

1.3.5在食物网研究中的应用 6

1.4本文研究的内容和目的 7

第二章 实验部分 8

2.1样品采集 8

2.2DNA提取 8

2.3高通量测序 9

第三章 实验结果与讨论 10

3.1自来水中细菌主要门类 10

3.1.1细菌群落分布特征图（Bar图） 10

3.1.2 Network网络分析 11

3.2典型细菌对随处理流程的变化 13

3.2.1细菌群落分布特征图（Heatmap图） 13

3.2.2样本间差异显著性分析 15

3.3群落多样性及随处理流程的变化 17

3.3.1 OUT数量韦恩图 17

3.3.2样本聚类分析 18

3.3.3系统物种发生进化树图 19

第四章 结论 22

结论 22

参考文献 23

致谢 27

第一章 综述

自来水厂中的细菌群落可能会影响自来水厂处理工艺的处理效果、出水水质等。但环境中的细菌有很难在人工条件下培养，极大地限制了对水中细菌群落特征的研究^[1]。近几年来高通量测序技术的出现和日益成熟为该领域的研究提供了契机。该技术可以同时对成千上万的DNA分子进行测序，实现了短时间内对大量细菌群落的鉴定。

1.1自来水厂处理工艺

水处理工艺一般由若干基本单元过程组成，通常将几种基本单元过程互相配合，形成水处理工艺，称为水处理工艺流程，主要是针对水源内的胶体和悬浮物以及病原微生物进行处理，从而达到生活用水标准^[2]。考虑到不同水源中的杂质组成、水质情况、污染程度的不同，所以在选择具体的处理工艺时也会有所不同。目前我国采用的基本上分为两种：一种主要是去除饮用水水源中的悬浮物和细菌等，但对各种溶解性化学物质的去除率并不高，这种处理工艺主要包括混凝、沉淀、过滤和消毒等单元，被称为常规处理工艺^[3]。也是我国自来水厂采用。另外一种主要是针对消毒副产物和常规处理工艺未能有效去除的污染物，通过对这些污染物的去除来实现饮用水的质量提高的深度处理工艺，其中活性炭技术是应用最为广泛^[4]。深度处理工艺该技术能够把水中的杂质收集起来，进而进行分离。目前使用两种。颗粒活性炭的处理效果稳定，在使用过程中采用水冲的形式进行反洗，一般的周期为6天左右^[5]。颗粒活性炭因其不易流失，能够重复利用的优点，多用于需要连续进行的轻度水污染处理中。粉末活性炭的优点是价格低廉，对设备没有要求，故多用于突发性事故的水净化处理工作中^[6]。

1.2高通量测序技术

在飞速发展的科学技术的推动下，DNA测序技术在飞速的发展，传统的测序技术由于其通量低，成本高的缺点^[7]，已经满足不了人们越来越高的研究需求，在这种情形下高通量测序技术应运而生。该技术不仅有着通量高成本低的优点，同时还保持了传统测序技术的高准确性^[8]。

1.2.1 454测序技术

454测序技术的原理是先用一些技术手段将一些长的链随机打断，例如超声波、氮气等，随后通过琼脂糖凝胶电泳回收的DNA片段。接着进行文库的制备，包括接头连接和磁珠钝化两步，片段的两端被加入接头，只有两端接头不同种类的才会被磁珠富集，随后将文库与测序磁珠等加入相关物质形成有包水乳浊液体系，每，包含一个磁珠和一跳单链DNA，，准备有350万个小孔的反应板，其中一个磁珠仅可以放入一个孔中，然后在PTP中加入测序试剂与磁珠，使之可用于上机测序，最后把四种碱依次加入反应板，每延伸一个或若干个碱基，，即可测定序列^[9-11]。该技术有着测序读长较长的优势，可以准确对读400个以上的碱基序列进行测序分析^[12]，但其同时也有着通量较低、成本相对较高的缺点

1.2.2 Solexa测序技术

Solexa测序是，该的原理是先用一些技术手段随机打断DNA序列，随后把适宜长度的DNA片段（100-200bp）回收，再为其接上通用接头并调整到适合的浓度之后，附着Flowcell（结合流动DNA的装置，其表面有能和DNA 接头相配对的接头）。DNA片段的头部会因为重力的作用向下弯曲，接触Flowcell上的位点（接头），形成一段类似“桥型”的DNA片段。之后开始进行PCR扩增，可以得到簇状目的片段。再利用4种荧光标记的染料进行后续的测序反应，每次循环中的可逆终止子可以用荧光标记的dNTP来代替，因为3’-OH末端存在着可以被识别的切割位置，所以每次循环只能够加入一个碱基。在合成过程中，焦磷酸盐会在每个碱基引入的同时释放，由于不同标记的碱基可以发出不同波段的荧光，所以通过记录每次循环的荧光信号信息并加以分析就可以得到原DNA片段的序列^[13]。该测序技术因其通量高、低错误率、低成本的优点被广泛应用^[14]。

1.2.3SOLID测序技术

SOLiD测序技术是 ，其原理是将DNA序列适合的片段，为其连接上通用接头，随后放入乳液中进行大量PCR扩增，接着进行微珠富集筛选带有，微珠上的模板后公家结合到玻片上，将之前用末端修饰的微珠沉积在一块拨片上。引物与文库模板上的PI接头序列杂交，随后用一套四色荧光标记的双碱基探针竞相与测序引物连接，在每次连接反应后就会得到相应的荧光信号，根据得到的荧光信号的颜色来推断碱基序列。这一根据的原理是利用双碱基配对原则。SOLID测序技术较前两种技术来说，它的准确更高，错误率仅为0.01%，但如果读长较短的话会给从头测序拼接带来困难^[15]。

1.3．高通量测序技术的应用

1.3.1 在海洋中的研究

海洋环境因其复杂多变使得环境中的微生物资源极其丰富，也具有其他环境中的无与伦比的基因功能和生态功能。Peressutti等用454测序技术在阿根廷海域对微生物浮游细菌生物结构进行了比较研究，研究发现从测出的36188个测序中发现4600个细菌序列，组成了280个种系列，从测出的47700个测序中发现2700个古细菌序列，只有5种不同的种系型^[16]。Xia等用454焦磷酸测序技术对几个海域中海洋气溶胶中的细菌群落多样性进行了揭示，结果表明相比挪威海域气溶胶样品中的微生物群落结构来说，太平洋海域的气溶胶样品中的微生物群落结构更加多样化，而且细菌可以通过海上气溶胶进行远距离传输^[17]。

1.3.2 在土壤中的研究

土壤中的微生物种类巨多，数量非常之大^[18]。据估计，全球土壤中的微生物种类可达数万种，数量甚至可以达到1029数量级^[19]。研究土壤中微生物群落结构特征对改善土壤土质、促进农业发展有着积极的意义。Roesch等使用454测序技术实现了对土壤微生物多样性的研究，研究发现，森林土壤细菌非常丰富，相对于农业区而言，未受干扰的地点可能具有更高的动植物多样性，并且对微生物多样性产生积极影响。在农业系统中，植物多样性低，异生物投入量高，整体物种多样性可能会降低到瓶颈，从中可以实现物种多样化，尽管数量有限。这表明农业管理方法对土壤中细菌的多样性起着重大的影响作用^[20]。Liu等利用高通量测序技术发现在低纬度地区观察到相对较高的细菌群落多样性，表明黑土区可能存在细菌群落的纬度多样性梯度。此外，结果还表明，黑土中的细菌群落组成可能会被农业实践改，而且土壤pH值在改变黑土中细菌群落组成方面起着重要作用，土壤pH值对黑土中细菌群分布的影响与其他土壤不同，表明还有其他土壤参数，如土壤碳含量，这些参数对黑土中的细菌群落组成有贡献，黑土区可能存在细菌纬向多样性梯度^[21]。徐瑛等将脱硫菌的筛选与 新一 代 高 通 量 测 序 技 术 相 结 合，发 现 土 壤 中 ( 假单胞菌属) 、Ochrobactrum( 苍白杆 菌属) 等多种脱硫功能菌^[22]。McGuire 等利用高通量测序技术发现土地利用转化可能导致土壤真菌群落的成分变化，这可能对养分循环产生功能性影响。研究结果还表明，真菌对伐木的敏感性可能高于土壤细菌群落^[23]。

1.3.3在污水中的研究

污水是由于某些有害化学物质的混入，或者由于温度的升高而造成水的使用价值降低或丧失，进而造成环境污染。污水的处理的结果与人类的健康息息相关，目前污水处理工艺应用最广泛的是利用微生物的新陈代谢来处理。而高通量测序技术能够就微生物的种类、功能等对污水的净化方面的研究提供相关的参考作用^[24-26]。Ye等通过Illumina公司HiSep 2000平台研究实验室规模下2个生物反应器中的提取的活性污泥中的微生物群落结构、功能配置和代谢途径。他们通过分析氨氧化古生菌（AOA）和氨氧化细菌（AOB）的相对丰度发现2个反应器中AOB比AOA更丰富，而且2个反应器中的活性污泥的微生物代谢模式极为相似^[27]。Lu等利用454高通量测序技术对不同类型工厂排放的污水样本进行了检测，并选择有效的基因序列用于细菌多样性分析和丰度分析。研究发现来自不同类型工厂的污水虽然理化性质相差很大，但其在降低微生物多样性、物种丰度以及影响河流均质化方面有着相似作用^[28]。Ye 等利用 454 高通量测序技术来研究污水处理厂含 盐污水中活性污泥、消化污泥、进水口和出水口的细菌 群落。对于每一个样本选择 18 808 个有效序列去做 细菌的多样性和丰度的分析。其中有 4 种优势菌种分 别 是 Alphaproteo Bacteria、Thermotogae、Deltaproteo Bacteria 和 Gammaproteo Bacteria。在这个污水样品中 发现分枝杆菌和弧菌属还包含致病性细菌^[29]。

1.3.4在人体上的研究

截止到目前，只有数量极少的人体微生物在遗传学上被鉴定和描述，对于它们是怎么样影响人类的健康及如何对人类得的一些疾病起作用的也是了解到一些皮毛。随着近几年高通量测序技术的出现让人类更好地了解到这些物种的来源，以及这些物种的某些代谢物与人类基因组可能产生的相互作用^[30]。Militello 等在临床样本中建立并评估了基于454 新一代HPV L1 扩增子测序（NGS）的HPV分型方法，对HPV16和HPV18阳性细胞系的混合物的分析表明，NGS方法可以在宽动态范围内可重复地量化每种HPV类型在多种感染中的比例。对HPV阳性临床样本的测试表明，NGS可以正确识别多种感染中的大量HPV类型。NGS方法在分析一组宫颈标本中也是有效的，这些标本在杂交捕获和线性探针测定中具有不一致的结果^[30]。Rutvisuttinunt 等研究调查了Illumina MiSeq平台对深度测序的应用，以从流感病毒分离株中获得完整的基因组序列信息。从泰国和尼泊尔收集的6个呼吸道急性临床标本中培养出流感病毒分离株。将从每种病毒分离物获得的DNA文库混合并同时对所有DNA文库进行测序。他们的实验可以 提高人们对流感病毒进化的了解，有助于发现新品种，提高在设计预防疫苗的精度^[31]。

1.3.5在食物网研究中的应用

Brown等通过Ｒoche 454 测序研 究毛里求斯马埃堡自然保护区本土珍稀物种蜥蜴 Leiolopisma telfairii 和入侵鼩鼱 Suncus Murinus 的猎物谱及 资源分配，结果表明尽管两种捕食者不存在种间捕食，但食物网分析和 Pianka 生态位重叠指数表明这两两种捕 食者存在很高程度的猎物重叠和较强的猎物资源竞争，清除外来入侵的鼩鼱应是保护蜥蜴的首要措施^[32]。Ando 等通过扩增植 物叶绿体 tＲNA L( trnL) 基因条形码结合 焦磷酸测序研究发现黑林鸽经常消耗引入的物种，而不仅仅是本地物种。在没有恢复原生种子植物的情况下快速根除一些引进的物种可能会减少这种鸽子的可用食物资源，因此建议在清除外来植物和保护本岛植物之间应该有个权衡，以保持黑林鸽的食物资源^[33]。Mollot 等基于构建香蕉园节肢动物 minibarcodes 数据库和 Ｒoche 454 高通量测序平台，通过建立种植牧草伏生臂形草 的香蕉园 和对照园比较的方式，比较了两种类型实验田捕食性天敌的猎物选择及对主要害虫香蕉象甲 控制作用。结果表明因为广食性捕食者转向捕食替换猎物，香蕉园种植牧草对天敌调控害虫种群可 能有负作用^[34]。Kajtoch通过 ABI Sanger 测序和高通量测序平台 解析了波兰中南部、波兰北部、乌克兰 西部和斯洛伐克-摩拉维亚地区四个地理种群干热象甲 Centricnemus leucogrammus 寄主植物的 ( 1，5- ) 和 两种基因的条形码，对基于 rbcL 和 trnL 两种基因条形码的寄主植物通过比较SOLiD测序技术和Solexa测序技术的解析深度，并分析这 4 个地理种群的寄主植物范围。研究表明 Illumina 高通量测序比Sanger传统测序具有更详尽的解析度; 并且，基于 rbcL 和 trnL 双基因条形码系统能为研究植食者的寄主植物 ( 至少鉴定到属) 提供足够的信息; 个不同地理种群的干热象甲食物谱并不相同，这可能反应了干热象甲的 地理种群的生态适应和遗传隔离，为保护稀有和濒危物种提供了借鉴^[35]。

1.4本文研究的内容和目的

自来水厂中的细菌群落可能对自来水处理工艺处理效果、出水水质等具有显著影响。传统的细菌分离培养技术对于环境样本中细菌群落的揭示具有较大的局限性，据报道环境中超过90%的细菌无法在人工条件下培养。近年来，分析生物技术的发展使得对于细菌群落的揭示有了新的依托。高通量测序技术等可以在较短时间内实现大量细菌群落的鉴定。鉴于此，本课题拟研究自来水厂中细菌群落及其变化情况，结果将为丰富和认识自来水中微生物生态提供数据支持。

第二章 实验部分

2.1样品采集

水样取自于南京市某自来水厂，采样点总共设有6个，分别为A1(原水)、A2（絮凝出水）、A3（沉淀出水）、A4（滤后水）、A5（消毒出水水）、A6（排泥水）。水厂具体处理工艺流程见图2-1。采样时，利用采样桶从相应采样点去除约1L样品至已灭菌不透光聚乙烯塑料瓶中，随后将取样瓶放置于冰盒中并在2h内送至实验室，所有样品立即进行后续处理分析。

图2-1 南京市某自来水厂处理工艺流程图

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