摘 要

酶是性能优异的催化剂，生物体内众多复杂的生理反应正是因为有酶的参与才能高效地完成。设法使酶在生物体外也能表现出高效的催化活性将给人类社会带来极大的便捷。本研究合成了新型无机纳米材料——枝状介孔二氧化硅（DMSNs），利用其固定生物酶P450BM3，在玻碳电极上成功地装配了P450BM3纳米反应器，直接电化学实验表明电极上的酶仍然具有电化学活性，进一步发现其对睾酮具有显著的催化活性。另外，通过表面氨基修饰和PDA孔道修饰，扩大了纳米反应器的应用范围，此三种纳米反应器均可用于体外睾酮水平的检测。本研究工作所制备的DMSNs孔径大，孔道均匀，载酶量高，生物相容性好，是一类优秀的载酶介质。

关键词：P450BM3 介孔二氧化硅 睾酮 纳米反应器

Construction of P450BM3 nanoreactor and its application in biosynthesis

Abstract

Enzymes are excellent catalysts, and many complex physiological reactions in living organisms can be efficiently accomplished because of the participation of enzymes. Trying to make the enzyme exhibit high catalytic activity outside the organism will bring great convenience to human society. In this study, a novel inorganic nanomaterial, dendritic mesoporous silica (DMSNs), was synthesized, on which the P450BM3 was successfully immobilized. Direct electrochemical experiments showed that the enzyme on the electrode is still electrochemically active and has been found to have significant catalytic activity against testosterone. In addition, we expanded the application range of the nanoreactor by adding amino group on its surface and PDA into its inner channel. All the three nanoreactors behave well in the detection of testosterones . The DMSNs prepared in this research work have large pore size, uniform pores, high enzyme loading and good biocompatibility, which is a really excellent enzyme-loading media.

Key Words: P450BM3; nanoreactor; enzyme; electrochemistry

目录

第一章 文献综述 1

1.1引言 1

1.2 P450酶概述 1

1.2.1 P450BM3概述 2

1.2.2 P450BM3催化的甾体羟基化 3

1.3介孔纳米二氧化硅概述 4

1.4 酶纳米反应器概述 5

第二章 基于DMSNs的P450BM3纳米反应器的构建 8

2.1 实验试剂 8

2.2 实验仪器 8

2.3 DMSNs的制备 9

2.4 NH₂-DMSNs的制备 9

2.5 PDA-DMSNs的制备 9

2.6 P450BM3/DMSNs、P450BM3/NH₂-DMSNs、P450BM3/PDA-DMSNs纳米复合材料的制备 10

2.7 纳米复合材料修饰的玻碳电极及电化学测试 10

第三章 结果表征与分析 11

3.1 DMSNs、NH₂-DMSNs、PDA-DMSNs三种材料的亚显微结构 11

3.2 DMSNs的BET测试 11

3.3 DMSNs、NH₂-DMSNs、PDA-DMSNs三种纳米复合材料的红外光谱检测 12

3.4 不同官能化DMSNs中P450BM3的直接电化学 13

3.5 P450BM3/DMSNs/GCE、P450BM3/NH₂-DMSNs/GCE、P450BM3/PDA-DMSNs/GCE对睾酮的电催化性能 15

第四章 本论文的成果与本领域的前景 17

4.1 本论文的成果 17

4.2 本领域的前景 17

参考文献 18

致谢 21

第一章 文献综述

1.1引言

纳米科学和生命科学是近期以来研究最热门的两门学科。纳米材料的颗粒尺寸比宏观物体要小得多，表现出不同于宏观材料的新特性，这些新特性打破了人们的常规思路，为常规物质开辟出了新的应用途径。通过改变纳米材料的分子和原子排布，可以人为地改变材料的物理化学性质，为新型功能材料的研制提供了新方法。酶纳米反应器是纳米科学和生命科学的完美结合，纳米材料可以将酶吸附在其表面，为人们在体外研究酶的生物特性创造了可能，不同的纳米材料可以负载不同的酶，不同的纳米材料又能得到不同的修饰，其中的多样性和偶然性激发了研究者们极大的热情，酶纳米反应器已经成为极热门的研究领域。

1.2 P450酶概述

细胞色素P450酶普遍存在于各种生命体中，在动植物界甚至微生物界都能寻觅到它的身影，广泛的分布彰显了它的重要性，自从它被分离之日起，科学界对它的研究就从未停止过，即便到今日，我们依然能从它身上探索到生命的原始信息。科学研究让越来越多的细胞色素P450酶展现在人们的眼前，这个酶系包含着数量巨大的成员，到目前为止一共发现了两万多种不同来源的P450酶，并且有更多的P450酶等待人们去发现。可根据P450酶催化生化反应时传递电子的方式的差异将它们分为不同的类型，然而，不论它们个体间的差异有多么悬殊，它们的还原态与CO络合后都能在450 nm处产生特异的吸收，这也就是它名字的来源[1]。细胞色素P450酶参与生物体内活性物质和外来干扰性物质的代谢。对于人体而言，P450酶分布在全身各处组织中，但最重要的分布在肝脏里，它参与肝脏对体内物质的代谢过程，研究指出，临床上所使用的药物的代谢过程，半数以上由P450酶完成。药物在体内的衰变进程，药物之间的相互反应，药物是否容易分解以及药效均和参与其代谢的细胞色素P450有关[2]。可见P450酶维持着生物体内环境的稳定，对人体机能的正常发挥非常重要，通过研究P450酶对药物的代谢过程，可以设计出药效更好的药物，促进医药事业的发展。

P450酶行使催化功能时需要依靠一定的外界条件，外界条件变化时，其生理功能也会做相应改变。P450酶在厌氧条件下催化底物发生还原反应，在有氧条件下，它借助亚铁血红素使氧气接受电子从而激活氧气，并将单个氧原子引入底物中使之氧化，这类氧化反应包括烯烃环氧化、碳氢键的羟基化、脱烷基化反应、偶联反应、成环反应等等，可催化的底物类型众多，包括萜类、肽类、芳香类化合物、固醇、糖类等等[3]，其催化的反应又表现出优异的化学选择性、区域选择性、立体选择性，总之，细胞色素P450酶的代谢功能十分强大，应用十分广泛，深受科研工作者的青睐。

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