摘 要

目的：自二十世纪以来，伴随着抗生素滥用导致多重耐药菌的出现，已经严重威胁到公众健康，研发新的药物和新的治疗手段替代抗生素治疗，已经成为各个国家科研工作的研究热点。其中光动力治疗抗菌作为一种新的治疗手段已经受到广泛的关注。光动力抗菌疗法是在合适光源的照射下，光敏剂吸收短波长的光，由基态 (S₀)经跃迁到单线态 (S₁)再转变为激发三线态 (T₁)，然后由激发三线态 (T₁)与周围介质中的氧分子发生反应，生成氢氧自由基 (•OH)或者单线态氧 (¹O₂)等活性物质，进一步作用于菌体，可与菌体的生物大分子（脂质、蛋白质、核酸）发生氧化反应，使菌体损伤、凋亡。基于光动力抗菌的基础上，我们设计并制备一种光响应性复合纳米抗菌剂以用于耐甲氧西林金黄色葡萄球菌感染的光动力治疗。基于此治疗方法，既能提高治疗效果，又能降低细菌耐药性概率。

方法：基于Hummers方法稍作修改制备氧化石墨烯纳米片 (GO)，进一步通过物理吸附将光敏剂二氢卟吩e6 (Ce6)负载到氧化石墨烯纳米片上，以制备氧化石墨烯负载二氢卟吩e6的复合物Ce6/GO。通过对制得的Ce6/GO进行荧光光谱学分析、粒径分析、光动力性质的测试，并在此基础上初步考察其对耐甲氧西林金黄色葡萄球菌的抑菌效果。

结论：实验结果表明光响应性复合纳米抗菌剂 (Ce6/GO，masss ratio : 1:10)在水溶液中的粒径为128±42 nm均匀分散， 400 nm和660 nm 有吸收，说明Ce6 已成功负载到GO上。以DPBF为单线态氧捕捉剂，Ce6/GO在660nm (100 mW/cm²)激光照射3 min，DPBF在410 nm处的吸收明显衰减，说明Ce6/GO能够产生较为大量的单线态氧；采用MTT法评价光响应性复合纳米抗菌剂对菌活力的抑制效果，实验结果表明10 mg/mL 的Ce6/GO光照后可以完全抑制耐甲氧西林金黄色葡萄球菌(MRSA)的菌活力；在此基础上，我们又做了光响应性复合纳米抗菌剂对耐甲氧西林金黄色葡萄球菌(MRSA)的抑菌圈实验，40 ug/mL Ce6/GO纳米体系光照后的抑菌效果与40 ug/ml万古霉素相当，且随着浓度的增加，抑菌效果不断增强。因此Ce6/GO复合纳米体系可以作为一个新型光响应性纳米抗菌剂，在激光诱导下产生大量单线态氧实现光动力抗菌，在临床抗菌应用中有明显的优势和发展前景。

关键词：光动力抗菌 氧化石墨烯(GO） 二氢卟吩e6 (Ce6) 耐甲氧西林金黄色葡萄球菌 (MRSA) 单线态氧

Study on novel photoresponsive nano-antibacterial agents

Abstract

Objective: Since the twentieth century, with the emergence of multi-drug-resistant bacteria caused by the abuse of antibiotics, it has seriously threatened public health. Research and development of new drugs and new treatment methods to replace antibiotic treatment has become a research hotspot in various countries. Among them, photodynamic therapy (PDT) as a new method of antimicrobial therapy has attracted wide attention. Photodynamic antimicrobial therapy is to absorb short-wavelength light by photosensitizer under the irradiation of suitable light source, and then change from ground state (S₀) to singlet state (S₁) to excitation triplet state (T₁). Then the excitation triplet state (T1) reacts with oxygen molecules in the surrounding medium to produce hydroxyl radicals (•OH) or singlet oxygen (¹O₂) and other active substances, which can further act on bacteria and bacteria. Biomacromolecules (lipids, proteins, nucleic acids) undergo oxidative reactions, causing bacterial damage and apoptosis. Based on photodynamic antimicrobial, we designed and prepared a photoresponsive composite nano-antimicrobial agent for photodynamic therapy of methicillin-resistant Staphylococcus aureus infection. Based on this treatment method, it can not only improve the therapeutic effect, but also reduce the probability of bacterial resistance.

Methods: Graphene oxide nanosheets (GO) were prepared by slightly modified Hummers method. Photosensitizer porin E6 (Ce6) was loaded onto graphene oxide nanosheets by physical adsorption to prepare graphene oxide-supported porin E6 composite Ce6/GO. Ce6/GO was prepared by fluorescence spectroscopy, particle size analysis and photodynamic properties test. On this basis, the bacteriostatic effect of Ce6/GO on methicillin-resistant Staphylococcus aureus was preliminarily investigated.

Conclusions：The experimental results show that the particle size of the photo-responsive composite nano-antimicrobial agent (Ce6/GO, masss ratio: 1:10) is 128 42 nm uniformly dispersed in aqueous solution, and it has absorption at 400 and 660 nm, indicating that Ce6 has been successfully loaded on GO. When DPBF was used as a singlet oxygen trapper, Ce6/GO was irradiated at 660 nm (100 mW/cm2) for 3 min, and DPBF absorption decreased significantly at 410 nm, which indicated that Ce6/GO could produce a large amount of singlet oxygen. MTT method was used to evaluate the inhibitory effect of photoresponsive composite nano-antimicrobial agents on bacterial activity. The results showed that 10 mg/mL Ce6/GO irradiation could completely inhibit methicillin-resistant Golden Grape ball. The bacteriostatic activity of MRSA was also studied. On this basis, the photoresponsive composite nano-antimicrobial agent was used to treat methicillin-resistant Staphylococcus aureus (MRSA). The bacteriostatic effect of 40 ug/mL Ce6/GO nano-system after illumination was similar to that of 40 ug/ml vancomycin, and the bacteriostatic effect increased with the increase of concentration. Therefore, Ce6/GO composite nano-system can be used as a new photoresponsive nano-antimicrobial agent, which can generate a large number of singlet oxygen under laser induction to achieve photodynamic antimicrobial. It has obvious advantages and development prospects in clinical antimicrobial applications.

Key words: Photodynamic Antibacterial; Graphene oxide(GO); Chlorin e6(Ce6);

Methicillin-resistant Staphylococcus aureus (MRSA) ; Singlet oxygen

目录

摘 要 I

Abstract III

第一章 文献综述 1

1.1研究背景 1

1.2光动力抗菌疗法研究现状 1

1.2.1 PDT的杀菌机制 2

1.2.2 aPDT的杀菌机制 2

1.3．光敏剂的分类和研究 3

1.3.1 第一代光敏剂 3

1.3.2第二代光敏剂 3

1.3.3 第三代光敏剂 5

1.4 aPDT的体外研究 5

1.4.1 aPDT对革兰氏阳性菌的研究 5

1.4.2 aPDT对革兰氏阴性菌的研究 6

1.5 aPDT的体内研究 6

1.6课题的提出 7

第二章 实验部分 8

2.1 实验仪器 8

2.2 实验试剂 9

2.3 Ce6/GO的合成 9

2.3.1 GO的合成 9

2.3.2 GO负载Ce6的合成 10

2.4 Ce6/GO的表征 10

2.4.1粒径分析 10

2.4.2单线态氧的测定 10

2.5 Ce6/GO抗菌性能检测 11

2.5.1 MRSA存活率（MTT）分析 11

2.5.2体外抑菌圈实验 12

第三章 结果与讨论 13

3.1 Ce6/GO的表征结果与讨论 13

3.2 荧光分析结果与讨论 14

3.3单线态氧测定结果与讨论 15

3.4 MRSA存活率（MTT）分析结果与讨论 16

3.5体外抑菌圈实验结果与讨论 17

第四章 结论与展望 18

4.1结论 18

4.2展望 18

参考文献 20

致谢 24

第一章 文献综述

1.1研究背景

十九世纪70年代Robert Koch和Louis Pasteur观察到空气传播的芽孢杆菌能有效的抑制炭疽芽孢杆菌的生长开始[1]，到1928年英国科学家弗莱明发现培养葡萄球菌的双碟上出现污染而生长出的一株霉菌能杀死周围的葡萄球菌[2]，再到1938年青霉素可以从实验室转到工厂实现量化生产，以及磺胺类药物风靡、喹诺酮药物合成，抗生素从提取到人工合成逐渐走进人们的生活，无论是战乱年代还是和平时期，抗生素都做出了巨大的贡献，拯救了无数人的生命。

从抗生素发展的历程来看，在治疗感染方面做出了功不可没的贡献。但是另一方面，抗生素的大量使用，作为筛选条件致使细菌在进化过程中，被诱导向耐药方向进化，导致出现了新型耐药细菌。弗莱明在1945年获得诺贝尔奖时就指出药物的滥用会给人类带来细菌耐药性的问题[3]。细菌耐药性的问题愈发突出，抗生素治疗和传统细胞生物学对细菌感染的治疗效果有所下降，临床感染的发生有了显著的增加，全球的耐药细菌感染又成为了现代医疗需要面对的一个重大问题。2014年4月世界卫生组织发布了一份覆盖全球91%人口的报告指出，致病菌已经对现有的大部分抗生素产生了耐药性，我们正进入了后抗生素时代[4]。国家卫计委发布的《2017年全国细菌耐药检测报告》也指出，大肠埃希菌对喹诺酮类耐药率、鲍曼不动杆菌、铜绿假单胞菌及肺炎克雷伯菌对碳青霉烯类的耐药率等呈现了明显的得上升[5]。“超级细菌”的出现，需要研究者们开发出新的强有力的抗菌策略和抗菌药物，以用来对抗细菌感染就变得尤其重要。其中，光动力抗菌疗法（Antimicrobial photodynamic therapy，aPDT）就是最受关注的手段之一。

1.2光动力抗菌疗法研究现状

100多年前Hermann von Tappeiner就根据日照下的草履虫在吖啶橙的作用下会产生致命伤害地实验得出“光动力反应”结论[6]，即一种在光照和光敏剂共同作用下会产生氧依赖性的反应。上世纪70年代兴起的光动力疗法（photodynamic therapy,PDT）是最初运用于肿瘤治疗的一种方法，通过对患者注射光敏剂，然后对病灶区域进行激光照射从而达到治疗目的地方法。光动力抗菌疗法就是在光动力疗法原理的基础上用于对抗感染的一种新方法，将光敏剂在合适波长光照的作用下，将生物组织中的分子氧活化成自由基或单线态氧等活性氧成分，从而达到杀灭机体中有害微生物的作用，并且有着定位强、毒副作用小、应用较为方便的特点。

1.2.1 PDT的杀菌机制

PDT的原理主要是适当波长的激光照射基态（S₀）光敏剂分子后，其两个原本在低能量轨道上相反自旋的电子，其中一个从单线态（S₁）跃迁到高能量轨道，即三重态(S₂)。激发态的光敏剂分子产生两种反应，一是与溶剂或底物发生反应，通过非氧分子或者氢转移释放出活性的离子化基团或自由基，活性基团进一步与基态氧反应生成过氧化氢或过氧化氢阴离子，再进一步与氧产生氧自由基，称为Type 1反应[7]。二是三重态的光敏剂直接与基态氧结合，产生的高活性的单线态氧，高线态氧可以与机体的蛋白、核酸等分子结合造成其氧化失活，称之为Type 2反应[7]。

1.2.2 aPDT的杀菌机制

aPDT的抗菌机制与PDT大概一致，在光敏剂、激发光、和氧的共同作用下，有大量的单线态氧和和自由基生成，达到破坏有害目标的目的[8]。首先是对细胞质膜或核酸产生作用或二者都有，使细胞内容物流失，并使膜转运功能得到有效的破坏和丧失酶活，达到灭活的要求；或是损伤双链或单链DNA，Salmon等以及Spesia等在试验中发现在经过aPDT后微生物质粒中的螺旋结构部分消失[9]。

1.3．光敏剂的分类和研究

光敏剂是光动力抗菌疗法中的重要要素，与抗生素作用有不同的机制，不需要到达特定的靶组织或与特定结构结合发生化学反应，因此其被微生物代谢、阻断、排泄的概率比较低[10]。理想的光敏剂应该具有以下特点：结构单一，性质稳定；强光毒性，副作用小；合成简单，清除较快；较长波长激发，活性氧产量高等。如今光敏剂已经经历了三代的发展。

1.3.1 第一代光敏剂

以血卟啉衍生物为代表的混合卟啉类光敏剂属于第一类光敏剂，1960年，一期血卟啉衍生物被RL Lipson和 EJ Baldes 经分离纯化而得到，后被应用于抗肿瘤治疗之中[11]。我国也在上世纪80年代成功研制出了癌光啉、癌卟啉和光卟啉三种混合卟啉制剂并进入临床试用[12]。目前，在一些表皮肿瘤治疗中已经应用到该研究成果，其已经成为了食管癌前病变巴雷特食管的最佳治疗手段之一[13]，在膀胱癌、脑瘤、胆管癌症治疗方面也取得了一定的成效[14]。但是第一代光敏剂仍然存在着很多缺点，其组织穿透力较短，存在皮肤光过敏现象，产生的单线态氧也较少，其复杂的混合物成分也会带来许多应用过程中的不稳定。

1.3.2第二代光敏剂

第二代光敏剂主要包括卟啉类、金属酞菁类以及稠环醌类[15]，与第一代光敏剂相比，性能上有了很大的提高，其暗毒性小，结构成分单一，靶向性高，产生的单线态氧丰富，有着更加高效的利用率。

（1）卟啉类衍生物