摘 要

随着生物药物的研究进展，新型抗菌肽已成为科学人员研究的新宠。乳酸菌（LAB）抗菌肽悄悄进入人们眼中，它是一种天然的抗菌剂，具有占据人类粘膜壁龛的能力，包括口腔、胃肠道和阴道。由于LAB安全性较高，因此抗菌肽已经广泛应用于食品添加剂中。其中，加氏乳杆菌（Lactobacillus gasseri）是一种原生微生物，其特征包括低pH环境的耐受性、对胆汁盐的抗性和对宿主上皮的粘附，有助于固定定殖。在人体中，加氏乳杆菌通过其抗菌活性、细菌素的产生以及先天和适应性系统的免疫调节使得人类获得各种健康益处。

本研究以加氏乳杆菌产新型抗菌肽Gassericin T为切入点，对新型抗菌肽进行分离纯化，细化分组其抑菌特性且得出抑菌谱，并对Gassericin T合成调控基因差异表达和信号通路进行初步探索。

关键词：新型抗菌肽 加氏乳杆菌 分离纯化 抗菌特性 抑菌谱

Isolation and purification of novel antimicrobial peptides and their antimicrobial properties

Abstract

In the wake of biological drugs, new antimicrobial peptides have become a new favorite of scientists. Lactic acid bacteria (LAB) antibacterial peptide quietly into people's eyes, it is a natural antibacterial agent, with the ability to occupy the human mucosal niches, including the mouth, gastrointestinal tract and vagina.Because of the high safety of LAB, antimicrobial peptides have been widely used in food additives. Lactobacillus gasseri is a kind of native microorganism, and its characteristics include tolerance to low pH environment, resistance to bile salts and adhesion to host epithelium, which is helpful for fixation and colonization. In the human body, lactobacillus casei provides a variety of health benefits through its antibacterial activity, bacteriocin production, and immune regulation of the innate and adaptive systems.

In this study, Gassericin T, a new type of antimicrobial peptide produced by lactobacillus Gassericin, was used as the entry point to isolate and purify the new antimicrobial peptide, refine and group its antimicrobial properties and obtain the antimicrobial spectrum, and preliminarily explore the differential expression of genes and signal pathway regulated by Gassericin T synthesis.

Key Words: New antimicrobial peptides; Lactobacillus gasseri; Isolation and Purification; Antimicrobial properties; Antimicrobial spectrum

目 录

摘要 I

ABSTRACT II

第一章 绪论 1

1.1 乳酸菌的研究进展 1

1.2 加氏乳杆菌研究现状 2

1.2.1 加氏乳杆菌概述 2

1.2.2 分离纯化方法 3

1.2.3 作用机理及抑菌活性测定方法 4

1.3 本实验具体内容与要求及实验设计路线 5

第二章 乳酸菌的优化培养条件 6

2.1 MRS培养基成分的优化 6

2.1.1 C、N源的优化 6

2.1.2 缓冲体系的优化 9

2.2 初始PH的调整 11

2.3 最适通氧量的确定 11

第三章 加氏乳杆菌的抑菌谱及抗菌特性研究 13

3.1 抗菌活性的测定——抑菌圈实验 13

3.1.1 实验材料 13

3.1.2 实验方法及步骤 14

3.1.3 结果与分析 16

3.2 抑菌谱的探究试验 19

3.2.1 实验材料 19

3.2.2 实验方法及步骤 19

3.2.3 结果与分析 20

第四章 Gassericin T的分离纯化 23

4.1 抗菌肽粗提取 23

4.1.1 硫酸铵沉淀法 23

4.1.2 有机溶剂萃取法 26

4.1.3 细胞吸附法 27

4.2 初步确定细菌素分子量及分子鉴定工作 27

4.2.1 PCR技术（聚合酶链式反应）——分子鉴定 27

4.2.2 琼脂糖凝胶电泳测定核酸分子量 29

4.2.3 SDS-聚丙烯肽胺凝胶电泳（SDS-PAGE）测定蛋白分子量 30

4.3 抗菌肽的进一步纯化工作 32

4.3.1 凝胶层析法中度纯化抗菌肽 32

4.3.2 反相高效液相色谱法高度纯化抗菌肽 34

第五章 总结与展望 35

5.1 本实验小结 35

5.2 有待进一步研究的问题及展望 35

参考文献 37

致谢 41

第一章 绪论

1.1 乳酸菌的研究进展

自二十世纪中旬开始以青霉素为首的抗生素成为了“救世良药”，但是由于药效较好人们逐渐开始滥用它们，大量致病菌进化，导致病原菌耐药性的形成日趋严重，特别是“超级细菌”出现后，人类更加迫切要求开发新型抗生素。到了二十世纪八十年代科学家以“天蚕素”为突破口，在各种动物身上发现了结构相像的抗菌多肽，抗菌肽的广谱抗菌活性和不易产生耐药性的特性有望在今后治疗人类疾病的事业中发挥重要作用。抗菌肽（antimicrobia peptides，AMPs）相较于传统抗菌素有很大的优势：首先，它来源广泛、性质稳定，对革兰氏阳性菌和阴性菌均有抑制作用，有的甚至还具有抗肿瘤细胞活性的功能，因此具有一定的临床应用价值。其次，AMPs很难产生耐药性，其作用机理主要在于影响细胞质膜，而一般细菌对细胞膜的组成结构和理化性质的影响很小，且由于抗菌肽无致畸作用、毒副作用小等优点，已引起生物医药科学领域的广泛关注^[1]。

乳酸菌（LAB）是“活的微生物，当给予足够的量时，对宿主的健康有益”。乳酸菌与维持黏膜稳态和免疫系统相关的条件有关，通过在胃肠道(GIT)和阴道中的预防和治疗应用来改善人类健康，它具有良好的生理作用：维持机体微生物稳态、增强机体免疫功能、预防和抑制肿瘤发生、提高营养吸收率、延缓机体衰老等^[2]。LAB是革兰氏阳性真菌学的一个系统进化多样性分支，以乳酸为主要代谢产物发酵葡萄糖，主要适用于营养丰富的环境，包括植物和食物生态系统以及哺乳动物粘膜，是GIT和双歧杆菌共同定植的第一批细菌，尽管后者在早期定植中占主导地位。口腔也被认为是肠道细菌的寄主，是LAB常见的粘膜生态位。

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