摘 要

Abstract V

第一章 文献综述 1

1.1 黄酮类化合物简介及槲皮素糖苷的合成 1

1.1.1 黄酮类化合物 1

1.1.2 槲皮素糖苷 2

1.1.3 槲皮素-3,4'-二葡萄糖苷 2

1.2 糖基转移酶 3

1.3 尿苷二磷酸葡萄糖再生和大肠杆菌表达系统 3

1.4 本论文立题意义和主要研究内容 4

1.4.1 立题意义 4

1.4.2 主要研究内容 4

第二章 双酶偶联法催化合成槲皮素槲皮素-3,4'-O-二葡萄糖苷 5

2.1 序言 5

2.2 实验材料和方法 5

2.2.1 菌株、质粒和生化试剂 6

2.2.2 实验仪器和试剂 8

2.2.3 培养基和培养条件 10

2.2.4 粗酶液的制备 10

2.2.5 蛋白浓度的测定 10

2.2.6 酶活的测定 10

2.2.7 催化反应的影响因素 12

2.2.8 HPLC检测 13

2.3 结果与讨论 14

2.3.1 重组菌株鉴定 14

2.3.2 粗酶液浓度对合成槲皮素-3,4'-O-二葡萄糖苷的影响 14

2.3.3 温度对合成槲皮素-3,4'-O-二葡萄糖苷的影响 16

2.3.4 pH 对合成槲皮素-3,4'-O-二葡萄糖苷的影响 16

2.4 本章小结 17

第三章 UGT73G1定点突变及突变酶催化合成QDG 18

3.1 前言 18

3.2 材料与方法 18

3.2.1 工具酶，分子量标准和试剂盒 18

3.2.2 实验准备 18

3.2.3 引物设计 18

3.2.4 基因定点突变方法 19

3.2.5 粗酶液的制取 20

3.2.6 测酶活的方法 20

3.3 结果与讨论 21

3.3.1 重组质粒鉴定 21

3.3.2 突变酶活力检测 21

3.4 本章小结 22

第四章 结论与展望 23

4.1 结论 23

4.2 展望 23

参考文献 24

摘要

糖基转移酶(GTs)在自然界植物中十分常见，可将糖分子从活化的糖基供体转移至受体上，可以部分提高受体分子水相溶解度、稳定性以及生理活性。在生物法合成天然产物的过程中发挥重要的作用。槲皮素-3,4'-O-二葡萄糖苷是一种槲皮素糖苷，具有抗氧化、清除自由基、抗菌等优异的生物活性。通常被用作抗心血管疾病的药物，治疗心肌梗塞等疾病，槲皮素-3,4'-O-二葡萄糖苷相较于普通槲皮素药理学效果更好。然而槲皮素-3,4'-O-二葡萄糖苷在自然界中含量较少。且传统的提取法产量低、成本高且会导致巨大的浪费。目前自然界中有大量的槲皮素资源得不到有效的利用。糖基转移酶可以催化槲皮素 3、7、3’和 4’位羟基，糖基化生成单糖苷或者双糖苷。本研究将洋葱来源的糖基转移酶 UGT73G1 和蔗糖合成酶 SUS1 偶联，以槲皮素和蔗糖为底物在合酶的催化下合成槲皮素-3,4'-O-二葡萄糖苷，将来源广泛且廉价的底物转化为效果更好的目的产物。

将含有pRSFDuet-UGT-SUS1基因的质粒转入大肠杆菌 BL21（DE3）进行发酵培养，诱导表达。同时对UGT73G1进行定点，设计了突变位点G124D，和并将其酶活与野生型进行对比。突变取其粗酶液催化槲皮素，对其产物鉴定，并从温度，pH，粗酶液浓度等几方面对催化反应进行优化，结果显示 ：30℃为其催化反应的最适温度，pH 8.0 的条件下稳定性最好，酶浓度为10mg/ml时催化效果最好。突变体G124D的酶活约为野生型的1.5倍。

关键词：糖基转移酶 生物合成 条件优化

Abstract

Glycosyltransferases are very common in natural plants, and can transfer sugar molecules from activated glycosyl donors to glycosyl or non-glycosyl acceptors, which can improve the water solubility, stability and biology of receptor molecules to some extent. active. It is of great importance in the enzymatic synthesis of natural products. Quercetin-3,4'-O-diglucoside is a quercetin glycoside with excellent biological activity such as oxidation resistance, free radical scavenging, and antibacterial activity. It is commonly used as a drug against cardiovascular disease to treat diseases such as myocardial infarction. Quercetin-3,4'-O-diglucoside has better efficacy than common rutin and quercetin. However, quercetin-3,4'-O-diglucoside is less abundant in nature. And the traditional extraction method has low yield, high cost and can lead to huge waste. Currently，Nature has a lot of inefficient use of resources quercetin. Glycosyltransferases can catalyze the 3, 7, 3' and 4' hydroxyl groups of quercetin, which are glycosylated to form monoglycosides or disaccharides. In this study, the onion-derived glycosyltransferase UGT73G1 was conjugated to sucrose synthase SUS1, and quercetin-3,4'-O-diglucoside was synthesized under the catalysis of quercetin and sucrose. Converting a broad and inexpensive substrate into a better-performing target product.

The plasmid containing the pRSFDuet-UGT-SUS1 gene into E. coli BL21 (DE3) culture fermentation, induce expression. The crude enzyme solution catalyzed whichever quercetin, its product was identified and optimized from several catalytic reaction temperature, pH, concentration of the crude enzyme solution, optimum temperature 30 ℃ results show that for a catalytic reaction, pH 8.0 in the best stability, enzyme concentration is 10mg / ml catalyst under the best conditions.

相关图片展示：