摘 要

维生素K2的发酵生产最常用的菌种为纳豆芽孢杆菌（Bacillus subtilis natto）。目前关于微生物发酵生产维生素K2的文献报道较多，而且目前的研究主要集中在菌种选育和发酵工艺优化上。本课题通过常温等离子诱变（ARTP）手段，结合维生素K2类似物、呼吸链抑制剂选育出维生素K2的高产菌株，再摇瓶研究几株菌的发酵特性，对其进行遗传稳定性的研究，最终选育出一株高产、发酵周期短的纳豆菌A13-12-2。ARTP处理时间为90s，结构类似物——维生素K3的浓度为10mg/L，呼吸链抑制剂——乙腈的浓度为80mg/mL，通过诱变筛选得到了一株较为优异的菌株，较出发菌株的维生素K2的产量提高了33.87%，提高了纳豆芽孢杆菌发酵生产维生素K2的能力，为实现工业化生产奠定了一定的基础。本项目的实施，对于提高我国维生素K相关产品的技术创新能力和市场竞争力以及人类战胜癌症、帕金森氏综合症等疑难疾病的折磨、提高人们的健康水平，在社会和经济方面都具有十分重要的意义。

关键词：维生素K2 ARTP 纳豆芽孢杆菌

Screened vitamin K2 High-yielding Strain combining atmospheric and room temperature plasma(ARTP)

ABSTRACT

Bacillus subtilis natto is the most commonly bacteria for the fermentation of vitamin K2. Currently, the number of the reports about microorganism fermentation is more and mainly focus on the screening of strains and the optimization of fermentation technology. This research adopted the method of atmospheric and room temperature plasma (ARTP), combined with vitamin K2 analogs and respiratory chain inhibitor to screen high-yield strain. Then, the fermentation characteristics of three high-yield strains were studied in shaking flask and hereditary stability was also investigated, eventually got a high-yield, shorter fermentation period Bacillus subtilis natto A13-12-2. The results showed that the processing time of ARTP was 90s, and the concentration of structural analogues —vitamin K3 and respiratory chain inhibition was 10mg/L and 80 mL/L respectively. By mutagenesis and screening, a excellent strain was achieved at last, which was 33.87% higher than that of control. It laid the foundation of the realization of industrialization production. It is important social and economic significance for vitamin K related products to improve technological innovation capability and market competitiveness and also has the significance of curing cancer and Parkinson's disease to improve people's health level.

Key words: Vitamin K2；ARTP；Bacillus natto

目 录

摘 要 I

ABSTRACT II

目 录 III

第一章 文献综述 1

1.1 维生素K2的概述 1

1.1.1 维生素K2的简介 1

1.1.2 维生素K2的基本功能 1

1.1.3 维生素K2的应用 2

1.2 维生素K2的来源 2

1.3 纳豆芽孢杆菌发酵产维生素K2的研究进展 3

1.3.1 纳豆芽孢杆菌简介 3

1.3.2 纳豆芽孢杆菌菌株筛选研究进展 3

1.4 纳豆芽孢杆菌合成维生素K2的代谢机理 4

1.5 本课题研究的目的和意义 5

第二章 实验材料与方法 6

2.1 实验材料 6

2.1.1 实验仪器 6

2.1.2 实验试剂 6

2.2 实验方法 7

2.2.1 实验菌种 7

2.2.2 培养基 7

2.2.3培养基灭菌方法 7

2.2.4 诱变筛选方法 7

2.2.5 发酵培养方法 8

2.2.6 维生素K2提取 7

2.3 分析方法 8

2.3.1甘油含量测定 8

2.3.2 菌体干重测定 9

2.3.3 产油量检测 9

第三章 结果与讨论 10

3.1诱变结果与讨论 10

3.2 发酵复筛结果考察 12

3.3遗传稳定性考察 10

第四章 结论与展望 15

4.1结论 15

4.2展望 15

参考文献 16

致 谢 19

第一章 文献综述

1.1维生素K2概述

1.1.1维生素K2简介

K族维生素是一组脂溶性的、对人体健康至关重要的维生素，能帮助凝血、把钙结合到骨骼中，防止钙在动脉中沉积。其中维生素K1（phylloquinone，叶绿醌）存在于绿叶蔬菜中，是膳食维生素K的主要来源，凝血的必需品，但是很难被人体吸收，能进入血液循环仅有10%；而维生素K2（menaquinones，甲萘醌）有多种结构式，常见的有合成的menaquinone4（MK-4）和天然的menaquinone7（MK-7），对防治血管硬化^[1-2]，改善骨密度有重要作用。

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